陳小林，南海珍，徐志南

(1.杭州德潤(rùn)全健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 杭州 311500；2.浙江大學(xué)化工與生物工程學(xué)院生物工程研究所，浙江 杭州 310027)

黃精是我國(guó)常用的中藥材，為百合科黃精屬多年生草本植物根莖的總稱，全球有60 余種，主要分布于北溫帶和北亞熱帶，我國(guó)有31種，黃精含有多種化學(xué)成分，主要包括多糖、甾體皂苷、三萜、生物堿、木脂素、黃酮、植物甾醇及揮發(fā)油等，其中多糖和甾體皂苷類成分在黃精中含量較大，為其主要藥效成分[1]。有關(guān)黃精的記載始見(jiàn)于《名醫(yī)別錄》，其性味甘、平，歸脾、肺、腎經(jīng)，黃精在降血糖和免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、提高學(xué)習(xí)和記憶能力以及預(yù)防心腦血管疾病等方面均有不錯(cuò)的效果[2-3]。目前黃精的應(yīng)用主要通過(guò)蒸煮炮制后，獲得黃精提取物后,作為中藥飲片應(yīng)用于臨床或者中成藥的生產(chǎn)。提取后的黃精渣一般都做丟棄處理，這在一方面帶來(lái)了環(huán)境問(wèn)題，另一方面對(duì)黃精資源也是一大浪費(fèi)。

紅曲屬物種是非致病性真菌，紅曲菌發(fā)酵能產(chǎn)生多種具有生理活性的次生代謝產(chǎn)物，主要有紅曲色素、monacolin K、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)[4]。許多研究表明有些紅曲霉屬的次生代謝物在改善高脂血癥、高血壓、高血糖、阿爾茨海默病發(fā)展有一定的作用[5]。Monacolin K 最早是于1979 年由日本學(xué)者遠(yuǎn)騰章教授在紅曲菌中發(fā)現(xiàn)的[6]。Monacolin K也稱為洛伐他汀，是紅曲霉生物活性代謝產(chǎn)物之一，洛伐他汀是一種3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑，能降低血清甘油三酯和總膽固醇，因此monacolin K已被廣泛用作降低血液膽固醇的有效藥物，是美國(guó)暢銷的藥物之一[7]。Monacolin K還可以抑制人類惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，降低小鼠肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[8]。Monacolin K結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 monacolin K的結(jié)構(gòu)式

許多的研究發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵(SSF)有一些生物技術(shù)上的優(yōu)點(diǎn)，例如更高的發(fā)酵生產(chǎn)力，更高的產(chǎn)物終濃度和較低的分解代謝抑制[9]。對(duì)于SSF中的monacolin K生產(chǎn)，最常用的底物是水稻，一些其他底物，如大豆、花生、甘蔗渣、小米、馬鈴薯可以用于monacolin K生產(chǎn)[10-11]。本研究以黃精渣為底物中的一種用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)monacolin K，研究物料含水量、黃精渣加入量、米粉加入量、黃豆粉加入量、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)monacolin K產(chǎn)量的影響，以提高產(chǎn)量，避免黃精渣的丟棄所產(chǎn)生的環(huán)境問(wèn)題，降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 紫色紅曲菌(Monascuspurpureus325)：杭州桐君堂生物科技有限公司；黃精(浙江桐君堂藥業(yè)有限公司)；洛伐他汀(Lovastatin，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；大米、黃豆、麩皮為市售。

紅曲菌液態(tài)培養(yǎng)基：葡萄糖4%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%。

1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(德國(guó)Waters 2695)，檢測(cè)器為Waters 2996；分析天平(Mettler Toledo Ax205)；HZQ-F280全溫振蕩培養(yǎng)箱(太倉(cāng)市華美生化儀器廠)；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；GR-B2074FNA冰箱(泰州樂(lè)金電子冷機(jī)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Monacolin K的檢測(cè)方法 取樣品粉碎過(guò)篩，精密稱量，加入50%乙醇提取，搖勻，超聲提取(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出后冷卻，用50%乙醇補(bǔ)足到刻度，取濾液用有機(jī)膜過(guò)濾即得待測(cè)液。對(duì)照品溶液：取lovastatin適量，精密稱量，用乙腈配成每毫升含有40 μg的溶液。即得。

流動(dòng)相：乙腈∶甲醇∶0.1%磷酸溶液=55∶5∶40；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm；流速 1 mL·min-1； 進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵方法 見(jiàn)圖2所示。

圖2 黃精渣固體發(fā)酵生產(chǎn)monacolin K流程簡(jiǎn)圖

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)紅曲菌發(fā)酵黃精渣產(chǎn)monacolin K的影響 取黃精渣300 g，拌入米粉150 g，黃豆粉150 g，攪拌均勻，使其含水量達(dá)到40%。隨后裝入發(fā)酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液態(tài)中20 mL，在22、25、28、31 ℃下發(fā)酵15 d，倒出物料，干燥后測(cè)定其中的monacolin K含量。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖3中趨勢(shì)可知，隨著溫度的升高，monacolin K的產(chǎn)量先增后降，22 ℃～25 ℃時(shí)，隨著溫度升高，monacolin K產(chǎn)量不斷提高，在25 ℃達(dá)峰值5.45 mg·g-1，隨后溫度升高，產(chǎn)量下降，因此在25 ℃條件下發(fā)酵相對(duì)來(lái)說(shuō)比較合適。

2.2 黃精渣含量對(duì)紅曲菌產(chǎn)monacolin K的影響 分別稱取黃精渣500、600、700、800、900 g，分別拌入米粉和黃豆粉為1∶1的混合粉500、400、300、200、100 g，使黃精渣含量分別為50%、60%、70%、80%、90%；攪拌均勻，控制其含水量為40%。隨后裝入發(fā)酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液40 mL，在25 ℃下發(fā)酵15 d后倒出物料，物料干燥后測(cè)定其中的monacolin K含量。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 黃精渣含量對(duì)monacolin K產(chǎn)量的影響

從圖4可看出，隨著黃精渣含量的變化，monacolin K的產(chǎn)量先增后降，當(dāng)黃精渣含量分別在60%和70%時(shí)，monacolin K的含量分別為5.865和5.832 9 mg·g-1，產(chǎn)量相差不明顯，但是黃精渣含量在60%左右時(shí)，monacolin K的含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，因此在黃精渣含量對(duì)紅曲菌產(chǎn)monacolin K的影響試驗(yàn)中，選取黃精渣含量為70%時(shí)較為合適。

2.3 含水量對(duì)紅曲菌發(fā)酵黃精渣產(chǎn)monacolin K的影響 取黃精渣700 g，拌入米粉150 g，黃豆粉150 g，攪拌均勻，調(diào)節(jié)其含水量分別為30%、35%、40%、45%、50%。隨后裝入發(fā)酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液40 mL，在25 ℃下發(fā)酵15 d，倒出物料，干燥后測(cè)定其中的monacolin K含量。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 含水量對(duì)monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖5可知，monacolin K產(chǎn)量隨著含水量的增加，呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在含水量為35%時(shí)候，monacolin K產(chǎn)量達(dá)到峰值6.51 mg·g-1，但是數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)較大，操作過(guò)程中存在一定的試驗(yàn)誤差，同時(shí)35%的含水量的條件下物料稍顯干硬。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)物料因干燥而松散，不利于菌體的生長(zhǎng)[12]，當(dāng)含水量為40%時(shí)，monacolin K產(chǎn)量相對(duì)較好可達(dá)到4.85 mg·g-1，此時(shí)物料不黏連成塊且不顯干燥,發(fā)酵過(guò)程平穩(wěn),有利于菌體生長(zhǎng)。當(dāng)含水量為50%時(shí)，發(fā)酵的底物結(jié)塊嚴(yán)重，monacolin K產(chǎn)量低。綜上可知雖然40%的含水量條件下發(fā)酵得到的monacolin K產(chǎn)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差比35%含水量的數(shù)值稍低，但是在綜合考慮試驗(yàn)誤差、菌體生長(zhǎng)以及產(chǎn)物產(chǎn)量的情況下，選取當(dāng)含水量為40%較為合適。

2.4 黃豆粉與米粉配比對(duì)紅曲菌發(fā)酵黃精渣產(chǎn)monacolin K的影響 控制黃精渣的含量為70%(取黃精渣700 g，其余300 g)，按照黃豆粉：米粉比例為1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,2∶1加入，調(diào)節(jié)其含水量為40%，隨后裝入發(fā)酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液40 mL，在25 ℃下發(fā)酵15 d，倒出物料，物料干燥后測(cè)定其中的monacolin K含量。試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 黃豆粉與米粉配比對(duì)monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖6可知，monacolin K的產(chǎn)量隨著米粉的增加呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)黃豆粉與米粉的比例為1∶2時(shí)，monacolin K的產(chǎn)量可以達(dá)到峰值5.29 mg·g-1，但是它的標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)較大，當(dāng)黃豆粉與米粉比例達(dá)到1∶1時(shí)，monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到4.05 mg·g-1。在本試驗(yàn)之前因?yàn)椴淮_定最佳配比，所以試驗(yàn)操作中一直采用黃豆粉與米粉配比為1∶1的比例來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，綜合考慮成本與monacolin K產(chǎn)量的因素后，選取黃豆粉與米粉的配比為1∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅曲菌發(fā)酵黃精渣產(chǎn)monacolin K的影響 取黃精渣700 g，拌入米粉150 g，黃豆粉150 g，攪拌均勻，使其含水量達(dá)到40%。裝入發(fā)酵瓶中，每瓶裝量200 g，121 ℃，滅菌45 min。冷卻后接種紅曲液態(tài)中40 mL，在25 ℃條件下分別發(fā)酵5、10、15、20、25、30 d，倒出物料，干燥后測(cè)定其中的monacolin K含量。試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，monacolin K的產(chǎn)量也一直增加，發(fā)酵前15 d基本呈現(xiàn)線性增加，發(fā)酵第15天時(shí)，monacolin K產(chǎn)量可達(dá)到5.95 mg·g-1；在15～30 d之間，monacolin K大量產(chǎn)生，當(dāng)發(fā)酵30 d后，monacolin K含量可達(dá)到16.21 mg·g-1，紅曲霉利用黃精渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵30 d較為合適。

3 結(jié)論

通過(guò)研究發(fā)酵溫度、黃精加入量、含水率、米粉和黃豆粉的配比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)monacolin K產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明當(dāng)含水量為40%、黃精加入量為70%，米粉與黃豆粉加入量為1∶1，在25 ℃下發(fā)酵30 d，monacolin K的產(chǎn)量可以達(dá)到16.21 mg·g-1。這一工作表明，紅曲霉能夠很好利用黃精渣進(jìn)行固

態(tài)發(fā)酵，并產(chǎn)生較高的monacolin K，這一研發(fā)工作對(duì)黃精產(chǎn)業(yè)深加工和開(kāi)發(fā)下游的黃精系列產(chǎn)品都具有重要的指導(dǎo)意義。