郭 睿， 張 瑤， 韓 雙， 王 寧

(陜西科技大學(xué) 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710021)

殼聚糖(CTS)是2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖通過β-(1，4)糖苷鍵連接而成的直鏈多糖，是一種天然存在的陽離子多糖[1]，可由甲殼素經(jīng)濃堿處理脫去N-乙?；频?。因CTS結(jié)構(gòu)中含有大量羥基及氨基，可用于吸附廢水中雜質(zhì)，CTS作為天然絮凝劑具有廣泛的應(yīng)用前景[2-3]。但因CTS水溶性差，只能溶解于酸性溶液中，應(yīng)用范圍受到很大限制[4-5]。目前改善殼聚糖水溶性的方法有羧甲基化、羥丙基化、烷基化以及通過化學(xué)反應(yīng)引入親水基團(tuán)等[6-8]。由于羥丙基殼聚糖(HPCS)保留了CTS原有的堿性和正電性，同時(shí)又改善了CTS的水溶性，所以近些年成為了研究重點(diǎn)[9]。施亦東等[10]在異丙醇為溶劑的條件下，用環(huán)氧丙烷與堿化殼聚糖反應(yīng)合成HPCS，研究表明：HPCS具有良好的水溶性，且保濕性和抗菌性較CTS都有顯著的提高，但對HPCS的相對分子質(zhì)量沒有進(jìn)行分析。溫俊杰等[11]通過微波法由殼聚糖與環(huán)氧丙烷反應(yīng)制備HPCS，雖然各項(xiàng)性能得到提高，但制備過程中需要特殊儀器。鐘超等[12]在堿性環(huán)境下，以 CTS-Fe(Ⅱ)為反應(yīng)物，環(huán)氧丙烷為改性劑，10%四甲基氫氧化銨為催化劑合成了殼聚糖亞鐵離子配合物的羥丙基化產(chǎn)物[HPCTS-Fe(Ⅱ)]，但CTS需要堿化過夜，耗時(shí)長，且相對分子質(zhì)量大幅度降低。相對分子質(zhì)量是絮凝劑的一個(gè)重要指標(biāo)，相對分子質(zhì)量高，在絮凝過程中可通過吸附架橋作用絮凝水中雜質(zhì)。而特性黏數(shù)越大，則絮凝劑的相對分子質(zhì)量越高。因此，可以通過分析HPCS的特性黏度來研究其相對分子質(zhì)量。響應(yīng)面法是一種較為科學(xué)和高效的工藝參數(shù)優(yōu)化方法，可以在保證實(shí)驗(yàn)精度的基礎(chǔ)上，盡量減少實(shí)驗(yàn)的次數(shù)[13]。本研究采用CTS、環(huán)氧丙烷為原料，異丙醇為溶劑，在NaOH堿化的條件下合成羥丙基殼聚糖(HPCS)；并以特性黏數(shù)為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了HPCS的最佳合成工藝參數(shù)，以期為羥丙基殼聚糖的工業(yè)化應(yīng)用提供原料來源。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1原料、試劑與儀器

殼聚糖(BR，脫乙酰度88%，相對分子質(zhì)量4.2×105)，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；環(huán)氧丙烷、異丙醇、乙醇、氫氧化鈉，均為市售分析純；25%四甲基氫氧化銨水溶液、茚三酮、 98%濃硫酸，均為化學(xué)純。

VECTOR-22型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀、ADVANCⅢ400 MHz 型核磁共振氫譜(1H NMR)儀(以D2O為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))，德國Burker公司；烏氏黏度計(jì)(Φ=0.5～0.6 mm)，上海啟航玻璃儀器廠；Q45+EDAX OctanePrime 型環(huán)境掃描電鏡(ESEM)，美國FEI公司；Ultima IV型X射線衍射(XRD)儀，上海仁特檢測儀器有限公司；Cary 60型紫外光譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2羥丙基殼聚糖(HPCS)的合成方法

將1 g殼聚糖粉末浸泡在30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～50%NaOH溶液中，溶脹10～60 min，除去上層堿液，取20 mL異丙醇，將堿化過的殼聚糖加入異丙醇中。攪拌30 min后，升溫至40～80 ℃，再緩慢加入6～16 g的環(huán)氧丙烷和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的四甲基氫氧化銨溶液。繼續(xù)反應(yīng)3～8 h，將得到的懸浮液靜置一段時(shí)間，除去上層清液，加入20 mL去離子水溶解。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.5%的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至7，加入50 mL的丙酮/乙醇(體積比2∶1)混合溶液，靜置后抽濾，然后依次用丙酮和乙醇洗滌、干燥后得到粗產(chǎn)物。以乙醇為溶劑索氏抽提8 h，在50 ℃下干燥后得到淡黃色的羥丙基殼聚糖。反應(yīng)方程式如下：

1.3分析與表征

1.3.1FT-IR分析 采用KBr壓片法，使用傅里葉紅外光譜儀對CTS和HPCS進(jìn)行表征。

1.3.21H NMR分析 以D2O為核磁試劑，使用核磁共振儀對HPCS進(jìn)行1H NMR表征。

1.3.3XRD分析 將CTS和HPCS用X射線衍射儀進(jìn)行測試，掃描范圍2θ為5～60°。

1.3.4ESEM分析 采用環(huán)境掃描電鏡對CTS及HPCS進(jìn)行測試，測試電壓30 kV。

1.3.5特性黏數(shù)的測定 稱取0.06 g充分干燥的羥丙基殼聚糖溶于50 mL CH3COOH/NaCl(物質(zhì)的量比2∶1)混合溶液中，在25 ℃下使用烏氏黏度計(jì)測定空白溶劑及HPCS混合溶液在管中流下所用時(shí)間t0和t，采用一點(diǎn)法(式(1))計(jì)算得到HPCS的特性黏數(shù)([η])，平行測定3次取平均值[14-15]。根據(jù)式(2)，計(jì)算HPCS的黏均相對分子質(zhì)量(Mv)。

[η]=[ηsp+3lnηr]/4C

(1)

(2)

式中：ηr—相對黏度，ηr=t/t0；ηsp—增比黏度，ηsp=ηr-1；C—羥丙基殼聚糖溶液質(zhì)量濃度， g/mL；Mv—HPCS的黏均相對分子質(zhì)量。

1.3.6取代度的測定

1.3.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別配制10、 20、 30、 40和50 mg/L的1,2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取不同質(zhì)量濃度的丙二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL于25 mL具塞比色管中，在冷水浴條件下緩慢向管內(nèi)加入8 mL濃硫酸，搖勻，于100 ℃加熱3 min后，放入冰浴冷卻，分別加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的茚三酮，30 ℃水浴靜置20 min，加濃硫酸定容至25 mL，靜置10 min，取出置于比色皿中，以1 mL蒸餾水作空白參比，測定592 nm處丙二醇吸光度(A)，以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=0.008 9C-0.027，R2=0.996 8，在C為10～50 mg/L時(shí)，線性關(guān)系良好。

1.3.6.2樣品測定 稱取0.05～0.1 g HPCS于100 mL容量瓶中，加入25 mL 0.5 mol/L H2SO4，加熱至樣品溶解，冷卻，室溫下加蒸餾水稀釋至刻度，取1 mL溶液于25 mL具塞比色管中，按1.3.6.1節(jié)操作，測得樣品溶液在592 nm處的A，按回歸方程計(jì)算得到丙二醇質(zhì)量濃度[16]。根據(jù)式(3)和式(4)計(jì)算樣品的取代度(DS):

(3)

(4)

式中:w—羥丙基質(zhì)量分?jǐn)?shù)， %；C—丙二醇的質(zhì)量濃度， mg/L； 0.776 3—丙二醇轉(zhuǎn)換為羥丙基的轉(zhuǎn)換值；m—羥丙基殼聚糖質(zhì)量， g；DS—產(chǎn)物的取代度； 161—?dú)ぞ厶菃卧南鄬Ψ肿淤|(zhì)量； 58—羥丙基的相對分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1合成工藝對HPCS特性黏數(shù)的影響

2.1.1反應(yīng)溫度 在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，堿化時(shí)間30 min，反應(yīng)時(shí)間6 h，環(huán)氧丙烷用量10 g條件下，考察反應(yīng)溫度對特性黏數(shù)的影響，結(jié)果見圖1(a)。

由圖1(a)可知，羥丙基殼聚糖的特性黏數(shù)隨溫度的上升表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值。原因是由于環(huán)氧丙烷沸點(diǎn)較低[17]，當(dāng)溫度較低時(shí)，原料分子間有效碰撞幾率低，羥丙基化程度低；當(dāng)溫度逐漸升高，殼聚糖與環(huán)氧丙烷充分接觸，分子之間有效碰撞幾率增加，羥丙基化程度增加；但當(dāng)溫度過高時(shí)，環(huán)氧丙烷的揮發(fā)量隨之增大，參與反應(yīng)的環(huán)氧丙烷減少，與殼聚糖反應(yīng)不完全；同時(shí)溫度升高，殼聚糖的降解速率加快，特性黏數(shù)大幅度降低。因此，溫度在60 ℃時(shí)為最佳值。

2.1.2反應(yīng)時(shí)間 在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，堿化時(shí)間30 min，反應(yīng)溫度60 ℃，環(huán)氧丙烷用量10 g條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對特性黏數(shù)的影響，結(jié)果見圖1(b)。

由圖1(b)可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，羥丙基殼聚糖的特性黏數(shù)出現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在6 h時(shí)特性黏數(shù)出現(xiàn)最大值。反應(yīng)時(shí)間過短，羥丙基化反應(yīng)不充分，接枝效率低，HPCS特性黏數(shù)較低；反應(yīng)時(shí)間過長，則會(huì)增加分子鏈的斷裂程度，殼聚糖大量降解，導(dǎo)致特性黏數(shù)下降。所以反應(yīng)時(shí)間選擇6 h比較合適。

2.1.3堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù) 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響HPCS特性黏數(shù)的一個(gè)重要因素。在堿化時(shí)間30 min，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間6 h，環(huán)氧丙烷用量10 g條件下，探討了堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對特性黏數(shù)的影響，結(jié)果見圖1(c)。

由圖1(c)可知，HPCS特性黏數(shù)隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，殼聚糖C6位羥基不易被活化，且殼聚糖分子間的氫鍵和部分晶區(qū)不易破壞，接枝反應(yīng)難以進(jìn)行，特性黏數(shù)較低；但當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，殼聚糖會(huì)在濃堿中大量降解，HPCS特性黏數(shù)大幅度減??；由圖1(c)可知，堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%最為合適。

2.1.4堿化時(shí)間 在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，反應(yīng)時(shí)間6 h，反應(yīng)溫度60 ℃，環(huán)氧丙烷用量10 g條件下，考察堿化時(shí)間對特性黏數(shù)的影響，結(jié)果見圖1(d)。

由圖1(d)可知，HPCS特性黏數(shù)隨著堿化時(shí)間的增加出現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在20 min出現(xiàn)最大值。堿化時(shí)間過短，殼聚糖不能溶脹，活性位點(diǎn)不能被活化，反應(yīng)程度低；堿化時(shí)間過長，特性黏數(shù)隨之減小，這是因?yàn)闅ぞ厶窃趬A液中會(huì)發(fā)生不同程度的降解，堿化時(shí)間越長，降解反應(yīng)越嚴(yán)重，特性黏數(shù)越低，所以堿化時(shí)間20 min最為合適。

2.1.5環(huán)氧丙烷用量 在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，反應(yīng)時(shí)間6 h，反應(yīng)溫度60 ℃，堿化時(shí)間20 min條件下，考察環(huán)氧丙烷用量對特性黏數(shù)的影響，結(jié)果見圖1(e)。

圖1 不同反應(yīng)條件對HPCS特性黏數(shù)的影響Fig. 1 Effect of different reaction conditions on intrinsic viscosity of HPCS

由圖1(e)可知，特性黏數(shù)隨著環(huán)氧丙烷用量的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。隨著環(huán)氧丙烷用量增加，殼聚糖與環(huán)氧丙烷接觸更加充分，反應(yīng)逐漸完全，反應(yīng)程度逐漸增大；當(dāng)環(huán)氧丙烷用量為12 g時(shí)，特性黏數(shù)達(dá)到最大值；繼續(xù)增加環(huán)氧丙烷的用量，特性黏數(shù)開始下降，說明反應(yīng)過程有副產(chǎn)物生成，影響反應(yīng)的正向進(jìn)行。所以環(huán)氧丙烷用量選擇12 g較合適。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化合成工藝

2.2.1回歸模型的建立及數(shù)據(jù)分析 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1)、堿化時(shí)間(X2) 和環(huán)氧丙烷用量(X3) 為自變量， 選用響應(yīng)面分析法中的 Box-Behnken Design 建立數(shù)學(xué)模型[18]，以特性黏數(shù)(Y)為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

采用Design expert 軟件與SAS 8e統(tǒng)計(jì)軟件包對表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，建立特性黏數(shù)的二次回歸方程如下：

二次回歸擬合后的回歸方程方差分析見表2。

由表2中F值的大小可知，在回歸方程的一次項(xiàng)中，各因素對特性黏數(shù)的影響程度為X3>X1>X2。通過方差分析可得回歸模型的F=86.81，P<0.000 1，說明該模型具有良好的顯著水平，失擬項(xiàng)的F=5.49，P=0.066 7>0.05，失擬不顯著。特性黏數(shù)模型的R2為0.991 1，校正后為0.979 7，變異系數(shù)較低為0.77，再一次驗(yàn)證回歸方程擬合程度好，證明試驗(yàn)的精確度較高，可靠性強(qiáng)。以上結(jié)果均表明回歸模型與實(shí)測值能較好的擬合，該模型可以用來對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 特性黏數(shù)回歸方程方差分析

2.2.2交互影響顯著性分析 圖2為各因素關(guān)于特性黏數(shù)的響應(yīng)面和等高線圖。

如圖所示，殼聚糖分子在2θ為10°、 15°和20°存在衍射峰。這是由于殼聚糖分子規(guī)整排列以及氫鍵作用導(dǎo)致殼聚糖分子存在部分晶區(qū)，這也是殼聚糖不溶于水的原因。當(dāng)在殼聚糖分子中引入羥丙基后，在2θ為10°的衍射峰接近消失，而在2θ為20°的衍射峰強(qiáng)度也明顯減弱，這是因?yàn)樵跉ぞ厶欠肿又械腃6羥基位引入羥丙基后，削弱了分子內(nèi)的氫鍵作用，其水溶性也因此提高。

圖2 HPCS特性黏數(shù)的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig. 2 Response surface and contour line of intrinsic viscosity of HPCS

從響應(yīng)曲面圖可以看出，響應(yīng)面開口朝下，特性黏數(shù)隨各因素值先增大后減小，說明此模型存在最大值的穩(wěn)定點(diǎn)。對穩(wěn)定點(diǎn)進(jìn)行分析，得出HPCS最優(yōu)合成工藝為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)29.8%，堿化時(shí)間20.3 min，環(huán)氧丙烷用量12.57 g，在此條件下，特性黏數(shù)為206.089 mL/g。

2.2.3回歸模型的驗(yàn)證 對HPCS合成工藝各影響因素的優(yōu)化值進(jìn)行驗(yàn)證。取NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 30%，堿化時(shí)間為20 min，環(huán)氧丙烷用量為12.6 g，于60 ℃下反應(yīng)6 h，HPCS特性黏數(shù)為206.32 mL/g，相對分子質(zhì)量2.738×105。實(shí)測值與預(yù)測值接近，相對誤差值為0.11%。說明該方程擬合度好，可以預(yù)測實(shí)際特性黏數(shù)。

2.3產(chǎn)物的分析與表征

2.3.1FT-IR分析 CTS與最佳工藝條件下合成的HPCS的紅外譜圖見圖3。在HPCS的FT-IR中，2970 cm-1處出現(xiàn)—CH3的伸縮振動(dòng)吸收峰，1380 cm-1處出現(xiàn)了—CH3彎曲振動(dòng)吸收峰，且CTS 經(jīng)過羥丙基反應(yīng)后，在原殼聚糖分子鏈1030 cm-1處C6-OH 的吸收峰減弱，表明羥丙基被成功引入到CTS分子上，且羥丙基化反應(yīng)主要發(fā)生在C6-OH上[19]。

2.3.21H NMR分析 將最佳工藝條件下得到的HPCS以D2O作溶劑，進(jìn)行1H NMR分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，δ4.7處為H-1質(zhì)子和溶劑的吸收峰，δ3.55～3.92為H-3、 H- 4、 H-5、 H- 6特征吸收峰，δ1.07處為H-9吸收峰即—CH3吸收峰；δ3.09為H-2和H-8吸收峰即—CH吸收峰；δ3.45為—CH2吸收峰。由此可證明，—CH2CH(OH)CH3被成功接枝到殼聚糖上[20-21]。

2.3.3XRD分析 CTS與最佳工藝條件下合成的HPCS的XRD譜圖見圖5。

圖3 CTS與HPCS的紅外譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of CTS and HPCS

圖4 HPCS的核磁共振氫譜Fig. 4 1H NMR spectrum of HPCS

圖5 CTS與HPCS的X射線衍射圖Fig. 5 XRD patterns of CTS and HPCS

2.3.4ESEM分析 CTS與最佳工藝條件下合成的HPCS的ESEM譜圖見圖6。

由圖6可以看出，CTS 與 HPCS相比，具有顯著的形貌差異。CTS呈現(xiàn)出耳狀的形貌，且表面相對平滑，而HPCS呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀外觀形貌，且表面相對粗糙。原因在于引入羥丙基后，打破了殼聚糖分子的內(nèi)部晶區(qū)，微觀形貌也發(fā)生明顯改變。

圖6 CTS(a)與HPCS(b)的環(huán)境掃描電鏡圖片F(xiàn)ig. 6 ESEM images of CTS(a) and HPCS(b)

2.4取代度(DS)的測定

取最佳條件下合成的HPCS按1.3.6節(jié)操作方法處理，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、式(3)和式(4)計(jì)算取代度值DS，平行測定3次，取平均值，得到羥丙基殼聚糖取代度為0.426。

綜上可知，在最佳工藝條件下測得HPCS取代度為0.426，特性黏數(shù)為206.34 mL/g，符合預(yù)期結(jié)果。

3 結(jié) 論

3.1采用環(huán)氧丙烷與殼聚糖(CTS)發(fā)生親核取代反應(yīng)合成羥丙基殼聚糖(HPCS)，并用FT-IR、1H NMR、XRD和 ESEM 對其結(jié)構(gòu)及形貌進(jìn)行表征，結(jié)果表明：羥丙基被成功接枝到殼聚糖上，HPCS成功合成。

3.2通過單因素與響應(yīng)面分析優(yōu)化了HPCS的合成條件，探討了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、堿化時(shí)間和環(huán)氧丙烷用量對HPCS特性黏數(shù)的影響。結(jié)果表明: HPCS合成的最佳工藝條件為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、堿化時(shí)間20 min、環(huán)氧丙烷用量12.6 g，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間6 h。在該工藝條件下，HPCS特性黏數(shù)為206.32 mL/g，取代度為0.426，相對分子質(zhì)量較高為2.738×105，與預(yù)期結(jié)果一致。