張一凡, 柳雨汐, 陳香君, 白 雪, 高育哲, 單秀峰, 肖志剛

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 糧食學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

0 引 言

小米,學(xué)名粟,俗稱(chēng)谷子,即粟的脫殼產(chǎn)品,古時(shí)稱(chēng)禾、稷、粱、谷、稗等,為禾本科狗尾草草本植物。小米的栽培具有悠久的歷史,原產(chǎn)于中國(guó)黃河流域,是我國(guó)的主要糧食,產(chǎn)量高達(dá)全世界的80%[1]。小米粒小,直徑僅為1 mm,卵圓形,品種繁多。按顏色可分為白、紅、黃、黑、橙、紫小米等,按成熟遲早可分早、中、晚,按籽粒黏性可分為糯粟和梗粟。小米營(yíng)養(yǎng)豐富,含有人體所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)還具有一定的藥用價(jià)值。

小米中蛋白質(zhì)和碳水化合物含量很豐富,纖維素含量也高于其他作物,含有人體所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)還具有一定的藥用價(jià)值[2]維生素是人生命活動(dòng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)素,大多數(shù)維生素不能在體內(nèi)合成,故多食用維生素含量高的食物是保證營(yíng)養(yǎng)全面的途徑。小米中VB1的含量較高,VA,VD,VC和VB12含量較低;一般糧食中不含有胡蘿卜素或含量較少,而100 g小米中胡蘿卜素含量0.12 mg。VB1具有保持循環(huán)、消化、神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)正常功能,調(diào)整胃腸道蠕動(dòng),參與糖代謝的作用,VB1缺乏常導(dǎo)致神經(jīng)、消化系統(tǒng)、心臟的炎癥和功能衰退,且易患腳氣病;適量食用小米可以有效調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能和生命代謝,補(bǔ)充人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。對(duì)于水溶性維生素的檢測(cè)技術(shù)可以分為兩類(lèi):微生物分析法和化學(xué)分析法,其中化學(xué)分析法主要包括分光光度計(jì)法、漫反射FI-TR法、高效毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法。目前,高效液相色譜法具有高壓、高效、高靈敏度、分析速度快等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于維生素的確定[3-11]。采用高效液相色譜法檢測(cè)VB1多以熒光檢測(cè)器為主。由于小米中的VB1含量較高,通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化提取條件,優(yōu)化色譜條件,建立應(yīng)用紫外檢測(cè)器測(cè)定谷物中VB1的合適方法。另外,針對(duì)不同產(chǎn)地維生素的比較目前研究也不夠深入,本課題在優(yōu)化的條件下,建立應(yīng)用紫外檢測(cè)器測(cè)定VB1的方法,并測(cè)定不同產(chǎn)地小米中的VB1的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:樣品小米(各地采集)。

試劑:甲醇(色譜純):上海金穗生物科技有限公司;磷酸二氫鉀(分析純):沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠(chǎng);磷酸(分析純):沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠(chǎng);冰醋酸(分析純):沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠(chǎng);鹽酸(分析純):沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器設(shè)備

多功能粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司;DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī),上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;AL204電子天平,上海精科實(shí)業(yè)有限公司; PHS-3C酸度計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;GL-21M高速離心機(jī),上海精密儀器研究所; SB-25-12DT超聲波提取機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司; AgiLent 1200LC高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司; UV-1200S紫外分光光度計(jì),上海翱藝儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

將不同產(chǎn)地的小米樣品分類(lèi)編號(hào),然后將小米樣品用多功能粉碎機(jī)研磨成粉末,過(guò)80目篩,分裝備用。

粉碎過(guò)篩后的小米加水溶解→超聲波提取→離心后取上清液→過(guò)濾→HPLC檢測(cè)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)量1.0 g小米樣品,在其他因素相同情況下分別考察溶劑濃度(水、0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1 mol/L鹽酸)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30)、超聲時(shí)間(0、15、30、45和60 min)、超聲溫度(20、30、40、50和60 ℃)對(duì)提取VB1的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)超聲波提取小米中VB1的單因素試驗(yàn)結(jié)果,把吸光度值作為響應(yīng)值,使用中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析。應(yīng)用軟件進(jìn)行試驗(yàn)的設(shè)計(jì),數(shù)據(jù)的處理以及優(yōu)化,選取最優(yōu)方案,試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Test factor level

1.3.4 高效液相法測(cè)定條件

采用C18色譜柱,流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸水溶液=20∶80,流速:0.3 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm,柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量:20 μL。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)量20 mgVB1標(biāo)準(zhǔn)品,加二級(jí)水定容到100 mL棕色容量瓶中,作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.2 mg/mL),將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 μg/mL的工作液,按照1.3.4的色譜條件和方法依次進(jìn)行測(cè)定,記錄對(duì)應(yīng)的峰面積,以峰面積為y軸,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得出VB1的線(xiàn)性方程。

1.3.6 小米VB1含量測(cè)定

取1 g粉碎過(guò)篩后的小米樣品溶解在11 mL二級(jí)水中,利用響應(yīng)面優(yōu)化的條件提取,然后在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液經(jīng)濾頭過(guò)濾后,按照1.3.4的色譜條件和方法進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)與分析結(jié)果

注: 1. 水; 2. 0.001 mol/l鹽酸; 3. 0.002 5 mol/l鹽酸; 4. 0.005 mol/l鹽酸; 5. 0.007 5 mol/l鹽酸; 6. 0.01 mol/l鹽酸; 7. 0.025 mol/l鹽酸; 8. 0.05 mol/l鹽酸; 9. 0.075 mol/l鹽酸; 10. 0.1 mol/l鹽酸圖1 溶劑濃度對(duì)提取VB1的影響Fig.1 Effect of solvent concentration on extraction of VB1

2.1.1 溶劑濃度對(duì)提取率影響

結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知,水為提取溶劑時(shí),提取液的吸光度最高,所以選取水為最終提取溶劑。

2.1.2 料液比對(duì)提取率影響

結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知,料液比在1∶10時(shí)吸光度最大,隨著溶劑量的增加,吸光度逐漸減小,在1∶20時(shí)迅速下降,其原因可能是達(dá)到最大提取量后,溶劑的增加稀釋了溶液的濃度,從而導(dǎo)致吸光度下降,最終確定最佳料液比為1∶10。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)提取率影響

結(jié)果如圖3所示。

圖2 料液比對(duì)超聲提取VB1的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on ultrasonic extraction of VB1

圖3 超聲時(shí)間對(duì)提取VB1的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on extraction of VB1

圖4 超聲溫度對(duì)提取VB1的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction of VB1

由圖3可知,隨著超聲時(shí)間的增加,提取液的吸光度逐漸增大,15 min時(shí)迅速增加,隨后開(kāi)始緩慢增加,45 min、60 min時(shí)吸光度增加的并不顯著,在吸光度高的前提下考慮到盡量縮短試驗(yàn)時(shí)間,選擇45 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.4 超聲溫度對(duì)提取率影響

結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知,隨著溫度的升高,提取液吸光度顯著增加,40 ℃達(dá)到頂峰,隨后緩慢下降,故選取40 ℃為最佳超聲溫度。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用超聲波法提取小米中VB1的單因素試驗(yàn)結(jié)果,最佳料液比是1∶10、最佳超聲時(shí)間是45 min、最佳超聲溫度是40 ℃。應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理優(yōu)化工藝參數(shù),進(jìn)行響應(yīng)面分析,分別選取料液比1∶5、1∶10、1∶15,超聲時(shí)間30 min、45 min、60 min,超聲溫度30 ℃、40 ℃、50 ℃作為每個(gè)變量的低中高三水平,共設(shè)計(jì)17組試驗(yàn),其中12個(gè)為分析試驗(yàn),5個(gè)為中心試驗(yàn),以估計(jì)誤差。具體試驗(yàn)內(nèi)容見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken Design and Results

2.2.2 回歸模型方差分析

應(yīng)用Box-Behnken進(jìn)行多元回歸擬合分析,可得到提取液吸光度(Y)與各單因素A(料液比)、B(超聲時(shí)間)、C(超聲溫度)之間的二次多項(xiàng)式模型式。

利用此二次回歸方程可以為優(yōu)化超聲波法提取小米中VB1含量提供較好的數(shù)學(xué)模型,可對(duì)提取液吸光度的變化進(jìn)行預(yù)測(cè)?；貧w模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)可知回歸模型具有高度的顯著性(P<0.000 1),決定系數(shù)R2=0.984 7,校正決定系數(shù)R2Adj=0.965 1,失擬項(xiàng)P=0.332 9>0.05,不顯著,說(shuō)明該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高,可以用該模型分析和預(yù)測(cè)超聲波法提取小米中VB1的工藝結(jié)果。由F值可知,3個(gè)因素對(duì)提取液吸光度的影響大小依次為料液比(A)>超聲溫度(C)>超聲時(shí)間(B)。且由P值可知,回歸模型中的一次項(xiàng)均顯著,其中料液比(A)、超聲溫度(C)均為極顯著;二次項(xiàng)均為極顯著,交互項(xiàng)AB和AC顯著。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)面圖分析的圖形是試驗(yàn)特定的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)自變量構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖,可以直觀(guān)的反映各個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值的影響,等高線(xiàn)的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱。料液比、超聲溫度和超聲時(shí)間3種因素之間的交互作用對(duì)提取液的吸光度影響顯著。

采用Design-Expert 8.0.6.1分析得到的回歸方程求解,得出料液比1∶11,超聲時(shí)間47 min,超聲溫度43 ℃,此時(shí)提取液的吸光度最高。為驗(yàn)證此方案的真實(shí)性,在此添加量條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面軟件得到料液比1∶11,超聲時(shí)間47 min,超聲溫度43 ℃為最佳提取條件,提取液吸光度0.571。故驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果在料液比1∶11,超聲時(shí)間47 min,超聲溫度43 ℃時(shí),進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果分別為0.574、0.582、0.569。平均值為0.575,與理論值相差0.7%,擬合度較好,對(duì)試驗(yàn)有較好的指導(dǎo)意義。

2.3 檢測(cè)條件的確定

用紫外分光光度計(jì)對(duì)配制好的的VB1標(biāo)準(zhǔn)品在190～400 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果在246 nm處VB1存在最大吸收峰,故選用246 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在選定的波長(zhǎng)下,測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間6.962 min。按照上述檢測(cè)方法測(cè)定小米樣品,樣品中VB1的出峰時(shí)間為7.036 min。根據(jù)出峰時(shí)間定性,峰面積定量,從而計(jì)算出樣品中VB1的含量。

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出最佳提取工藝為:料液比1∶11,超聲時(shí)間47 min,超聲溫度43 ℃,結(jié)果表明3種因素對(duì)小米中VB1的提取均有顯著影響,3個(gè)因素對(duì)提取液吸光度的影響大小依次為料液比(A)>超聲溫度(C)>超聲時(shí)間(B)。另外,通過(guò)試驗(yàn)確定最終色譜條件:流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液∶甲醇=80∶20,流速0.3 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm,柱溫為30 ℃。VB1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=64.769X+1.404 7,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3,在0.05 μg/mL～1.2 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好線(xiàn)性關(guān)系。按上述色譜條件和方法測(cè)定小米樣品中VB1的含量,樣品平行配制3份,測(cè)得含量為0.536 mg/100 g。該方法簡(jiǎn)便、快速,對(duì)應(yīng)用紫外檢測(cè)器測(cè)定谷物中VB1具有一定參考價(jià)值,可為VB1的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。