范穌圳 徐林 浦湧

在多種心臟疾病中,離子通道的功能紊亂和細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)異?？梢鹦穆墒С：托募∈湛s功能障礙。既往生理學(xué)研究表明,鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent kinaseⅡ,CaMKⅡ)是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Na＋、K＋、Ca2＋等離子通道活性和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的重要激酶。諸如心肌缺血-再灌注損傷、急性心肌梗死(AMI)、心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)、慢性心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰)等疾病都涉及CaMKⅡ的過(guò)度激活及下游蛋白的功能異常。因此,調(diào)節(jié)CaMKⅡ活性可能會(huì)成為心律失常預(yù)防和治療的重要措施。筆者對(duì)近期有關(guān)CaMKⅡ信號(hào)通路的研究進(jìn)行綜述。

1 CaMKⅡ的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

1.1 CaMKⅡ的結(jié)構(gòu)

CaMKⅡ是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,有α、β、γ、δ四種基因表型,CaMKⅡδ是心臟主要表型。CaMKⅡ分子由6～12個(gè)多聚體亞單位組成,形成齒輪狀結(jié)構(gòu)。每個(gè)CaMKⅡ亞單位包含3個(gè)不同的單元域,即羧基端結(jié)合域、包含自我抑制位點(diǎn)和鈣調(diào)蛋白(calmodulin,Ca M)結(jié)合位點(diǎn)的中間調(diào)節(jié)域、氨基端催化域。

1.2 CaMKⅡ的激活

目前已發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中CaMKⅡ存在四種激活途徑,如圖1,現(xiàn)分述如下。

圖1 CaMKⅡ的4條激活途徑

1.2.1 CaMKⅡ的Ca2＋-Ca M依賴性激活 心肌收縮期時(shí),胞內(nèi)Ca2＋增多,形成Ca2＋-Ca M的復(fù)合物同CaMKⅡ的調(diào)節(jié)域結(jié)合,調(diào)節(jié)域T206/207對(duì)催化域的自我抑制消除,激活該酶。當(dāng)三磷酸腺苷(ATP)或Mg2＋存在時(shí),細(xì)胞內(nèi)Ca2＋-Ca M的濃度持續(xù)升高會(huì)使自抑區(qū)Thr286/287自磷酸化,稱為自磷酸化激活,同時(shí)也使Ca M與CaMKⅡ的親和力極大增加,稱為“Ca M捕獲(Ca M trapping)”。生理?xiàng)l件下,Ca M與CaMKⅡ解離后,自我調(diào)節(jié)域T305/306被磷酸化,防止Ca M的再次結(jié)合和CaMKⅡ被過(guò)度激活。

1.2.2 CaMKⅡ的氧化激活 在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激下,胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)升高時(shí),ROS通過(guò)氧化調(diào)節(jié)域上的蛋氨酸殘基Met281/282,激活CaMKⅡ,稱為氧化激活。CaMKⅡ氧化激活也需要起始的Ca2＋-CaM結(jié)合啟動(dòng),但與自磷酸化激活不同,蛋氨酸殘基氧化會(huì)阻止“Ca M捕獲”。Yao等[1]觀察到ROS產(chǎn)物增多會(huì)使得INa-L增加、胞內(nèi)鈉超載和鈣超載從而間接激活CaMKⅡ。Kohlhaas等[2]還發(fā)現(xiàn)線粒體ROS合成系統(tǒng)會(huì)受胞內(nèi)鈉濃度升高的刺激而激活,ROS對(duì)CaMKⅡ的激活效應(yīng)通過(guò)這一途徑被放大,提示病理?xiàng)l件下的CaMKⅡ的氧化激活可能會(huì)形成正反饋的環(huán)路。

1.2.3 CaMKⅡ的糖化激活 研究[3]表明,CaMKⅡ被Ca2＋-Ca M始動(dòng)激活后,葡萄糖與尿苷二磷酸(UDP)經(jīng)氧-氮乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase,OGT)生成的氧-氮乙酰葡萄糖胺(O-GLc NAc)作用于CaMKⅡ調(diào)節(jié)域上的S279/280位點(diǎn),啟動(dòng)CaMKⅡ自主活性,這種O-GLc NAc調(diào)節(jié)的CaMKⅡ激活可以誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)Ca2＋滲漏,干擾離子通道功能,可引起糖尿病性心臟病和心律失常。

1.2.4 CaMKⅡ的一氧化氮激活 晚近研究[4]發(fā)現(xiàn),心肌細(xì)胞β-受體(β-AR)興奮后,會(huì)激活蛋白激酶B(PKB),PKB激活一氧化氮合酶(NOS)產(chǎn)生NO,NO則作用于CaMKⅡ調(diào)節(jié)域上的硝基化位點(diǎn),啟動(dòng)CaMKⅡ活性并導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2＋滲漏,進(jìn)而誘發(fā)心律失常。研究表明,異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的肌漿網(wǎng)鈣滲漏能被NOS抑制劑L-NAME阻斷,NOS基因敲除小鼠在ISO刺激下沒(méi)有出現(xiàn)鈣滲漏的增加。

2 CaMKⅡ與離子通道和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)

觸發(fā)激動(dòng)是繼動(dòng)作電位(AP)上升支后的膜電位震蕩,其不能自發(fā)的獨(dú)立產(chǎn)生,總是依賴于正常除極后發(fā)生,因此稱為后除極。后除極包括早后除極(EAD)和延遲后除極(DAD)。EAD發(fā)生在AP的2相或3相,DAD發(fā)生在復(fù)極化完成或接近完成時(shí)。后除極只要達(dá)到閾電位,就可激活內(nèi)向電流,產(chǎn)生一次新的興奮,新的自發(fā)性AP是觸發(fā)激動(dòng)的結(jié)果。CaMKⅡ可以通過(guò)改變離子通道或鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的活性,誘發(fā)EAD或DAD,繼而觸發(fā)心律失常。

2.1 CaMKⅡ?qū)﹄x子通道的調(diào)控

2.1.1 CaMKⅡ?qū)︹c通道的調(diào)控 CaMKⅡ可磷酸化Nav1.5晚鈉電流(INa-L)通道,增加細(xì)胞內(nèi)Na＋濃度,造成胞內(nèi)鈉超載,直接引起EAD。除此之外,過(guò)高的胞內(nèi)Na＋濃度可能會(huì)激活Na＋-Ca2＋交換體(Na＋-Ca2＋exchanger,NCX)的反向轉(zhuǎn)運(yùn)將Ca2＋運(yùn)入胞內(nèi),間接造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載[5],通過(guò)影響鈣觸發(fā)的鈣釋放(CICR),導(dǎo)致DAD和心律失常的發(fā)生[6－7]。Wanger等[6]和Sag等[8]觀察到CaMKⅡδc過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)INa-L的增高,AP時(shí)程的延長(zhǎng)和EAD的增多。

2.1.2 CaMKⅡ?qū)︹浲ǖ赖恼{(diào)控CaMKⅡ?qū)﹄妷洪T(mén)控K＋通道Kv1、Kv2、Kv3、Kv4和Kv7(h ERG)、KCNQ1也有調(diào)節(jié)作用。CaMKⅡ可以直接磷酸化Kv4.3 Ser-550位點(diǎn),減慢通道失活,并加速其復(fù)活,上調(diào)Ito峰值,縮短AP的時(shí)程[9]。CaMKⅡ能磷酸化KCNQ1延遲整流鉀通道T482/S484位點(diǎn),下調(diào)Iks,增加AP時(shí)程[10]。心衰時(shí),常出現(xiàn)CaMKⅡ-KCNQ1的過(guò)度磷酸化,AP時(shí)程的延長(zhǎng),從而誘發(fā)心律失常。

2.1.3 CaMKⅡ?qū)︹}通道的調(diào)控 CaMKⅡ可以激活轉(zhuǎn)錄因子NFκB下調(diào)電壓門(mén)控鈣通道(L-type calcium channel,LTCC)α亞單位(Cav1.2)表達(dá),CaMKⅡ還可以直接磷酸化LTCC,總效應(yīng)表現(xiàn)為增加心肌細(xì)胞的Ca2＋內(nèi)流[11],稱鈣電流(ICa)易化作用。病理狀態(tài)下,CaMKⅡ過(guò)度激活時(shí),LTCC失活減慢,ICa峰值增加,并影響CICR和心肌細(xì)胞的收縮功能。ICa的增加也增加內(nèi)向INCX,誘發(fā)EAD,引起心律失常[12]。

2.2 CaMKⅡ與鈣轉(zhuǎn)運(yùn)

心室收縮期,CaMKⅡ磷酸化肌漿網(wǎng)(SR)上的蘭尼堿受體(RyR2)S2814位點(diǎn),激活RyR2,使SR鈣庫(kù)中的Ca2＋大量釋放至胞質(zhì)中。心室肌舒張期,大部分的Ca2＋由SR鈣泵(sarcoplasmic reticulum Ca2＋-ATPase,SERCA2a)重回收至SR,少部分由NCX轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。受磷蛋白(PLN)是SERCA2a活性的負(fù)性調(diào)控蛋白,CaMKⅡ可通過(guò)對(duì)磷酸化PLN的T17位點(diǎn),解除PLN對(duì)鈣泵的抑制,恢復(fù)鈣泵的活性,從而Ca2＋的重回收。CaMKⅡ過(guò)度激活使舒張期RyR2過(guò)磷酸化造成的Ca2＋外流至胞質(zhì)稱鈣滲漏,過(guò)高的Ca2＋激活NCX,產(chǎn)生的瞬時(shí)內(nèi)向電流(transient inward current,ITI),誘發(fā)DAD。Maier等[13]和Zhang等[14]觀察到CaMKⅡδc過(guò)表達(dá)TG小鼠心肌細(xì)胞在ISO的誘導(dǎo)下,鈣滲漏引發(fā)的DAD較對(duì)照組多,異常節(jié)律增加。

3 CaMKⅡ在不同病理生理?xiàng)l件下的致心律失常機(jī)制

3.1 CaMKⅡ與AMI及再灌注損傷

惡性心律失常是AMI病人的主要死因之一。由于AMI患者的心肌缺血缺氧,糖酵解使胞內(nèi)H＋、Na＋、Ca2＋濃度相繼異常增加,CaMKⅡ被過(guò)度激活[15]。缺血缺氧時(shí)及酸性環(huán)境下,SERCA2a和RyR2也出現(xiàn)功能障礙。但當(dāng)再灌注后,由于ATP合成的恢復(fù),SERCA2a和Ry R2過(guò)度激活,Ca2＋迅速進(jìn)入SR,造成SR鈣超載和舒張期鈣滲漏,并會(huì)激活NCX誘發(fā)DAD,進(jìn)而導(dǎo)致室性心動(dòng)過(guò)速和心室顫動(dòng)。

3.2 CaMKⅡ與心衰

在心衰的病理過(guò)程中,CaMKⅡ過(guò)表達(dá)和活性增高常誘發(fā)嚴(yán)重的心律失常和收縮功能障礙。Luo、Andrson[16]和Zhang等[17]的研究證實(shí),由于心衰CaMKⅡ過(guò)表達(dá),PLN T17磷酸化的增多,調(diào)節(jié)SERCA2a活性的作用減弱。同時(shí)由于SERCA2a表達(dá)的減少,SERCA2a與PLN的比例失調(diào),鈣泵功能?chē)?yán)重受損,使得心衰患者CaMKⅡ-RyR過(guò)度激活引起的鈣滲漏不能通過(guò)SERCA2a回收,誘發(fā)心律失常。Toischer等[18]觀察到主動(dòng)脈縮窄(TAC)法心衰模型小鼠,CaMKⅡT287自磷酸化水平增高和活性的增強(qiáng),使Nav1.5通道過(guò)磷酸化并增加INa-L,使得AP時(shí)程延長(zhǎng)并易誘發(fā)EAD。

3.3 CaMKⅡ與房顫

CaMKⅡ所造成的鈣滲漏是房顫的病理過(guò)程之一。Yan等[19]觀察到老齡C57B/6J小鼠的心房肌細(xì)胞c-Jun氨基末端激酶-2(c-Jun N-terminal kinase,JNK2)活性明顯增強(qiáng),而JNK2能增加CaMKⅡ的磷酸化激活,增加房顫的發(fā)生。Voigt等[20]收集慢性房顫病人的右房標(biāo)本后發(fā)現(xiàn),患者相比于正常竇性心律的人表現(xiàn)出CaMKⅡT287自磷酸化和RyR2 S2814磷酸化的增加。

房顫還通過(guò)CaMKⅡ增強(qiáng)INa-L,進(jìn)而通過(guò)增強(qiáng)CaMKⅡ氧化激活,加重鈣滲漏。Onal等[21]等應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬人心房肌細(xì)胞AP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表明,持續(xù)的CaMKⅡ過(guò)度激活和INa-L的增強(qiáng)會(huì)影響胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的平衡,誘發(fā)后除極。Neef等[22]研究發(fā)現(xiàn),慢性房顫相比于竇性心律,會(huì)有鈣滲漏的明顯增強(qiáng)。因此,CaMKⅡ引起的鈣滲漏、增強(qiáng)INa-L是房顫發(fā)生的機(jī)制之一。

4 CaMKⅡ的抑制劑

CaMKⅡ與多種疾病合并出現(xiàn)的心律失常密切相關(guān),亦有實(shí)驗(yàn)表明使用CaMKⅡ抑制劑下調(diào)CaMKⅡ活性能減少心律失常的發(fā)生。目前常用的CaMKⅡ的抑制劑有化學(xué)合成的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和合成肽類抑制劑。研究表明,CaMKⅡ抑制劑能減少心肌缺血-再灌注損傷相關(guān)病理改變及心衰模型動(dòng)物或人心臟細(xì)胞異常節(jié)律的發(fā)生,減少房顫的發(fā)作。

4.1 化學(xué)合成的競(jìng)爭(zhēng)性CaMKⅡ抑制劑

化學(xué)合成的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑包括KN-93/KN-62,其中KN-93在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多。KN-93不僅能和Ca2＋/Ca M結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性抑制CaMKⅡ活性,還能直接抑制LTCC、IKr通道和電壓門(mén)控K＋通道,AMI患者心律失常與心肌細(xì)胞酸中毒密切相關(guān),Pedersen等[23]進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn),KN-93能減少心肌細(xì)胞酸中毒后室性心動(dòng)過(guò)速的發(fā)生。Yan等[19]觀察到KN-93以及JNK抑制劑JNK2I-IX能阻斷老齡房顫小鼠JNK-CaMKⅡ信號(hào)通路的過(guò)度激活,減少房顫的發(fā)作。Neef等[22]研究發(fā)現(xiàn)慢性房顫患者心房細(xì)胞的鈣滲漏能被KN-93所抑制。

但KN-93尚不能口服給藥,且KN-93的阻斷作用不具有特異性,而帶來(lái)較多的副作用。Warren等[24]應(yīng)用光學(xué)成像技術(shù)觀察到,KN-93對(duì)左右室缺血心肌細(xì)胞的效應(yīng)存在差異,會(huì)降低右室流出道細(xì)胞的傳導(dǎo)性,具有一定的致心律失常性。Bell等[25]觀察到離體大鼠心臟在復(fù)流后給予KN-93會(huì)出現(xiàn)心肌收縮力的減弱和緩慢型心律失常。

4.2 合成肽類CaMKⅡ抑制劑

AIP(autocamtide-2 inhibitor proteins)和AC3-I(autocamtide-3 inhibitor)是人工合成的多肽,為基于底物的CaMKⅡ抑制劑,其對(duì)CaMKⅡ的抑制作用不受Ca2＋-Ca M的影響,即對(duì)鈣依賴的或非鈣依賴途徑均有抑制作用。Toischer等[18]研究發(fā)現(xiàn)AIP能減弱主動(dòng)脈縮窄法(TAC)心衰模型小鼠INa-L、AP時(shí)程和鈣滲漏,減少DAD。Yan等[19]觀察到AIP能減少老齡房顫小鼠JNK-CaMKⅡ過(guò)度激活,減少房顫的發(fā)作。然而,AIP在體內(nèi)易被降解,且AIP不能口服給藥,這給其臨床應(yīng)用帶來(lái)一定的局限性。

4.3 新型CaMKⅡ抑制劑

SMP-114(Rimacalib)為異惡唑(isoxazol)衍生物,是一種已進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)的抗風(fēng)濕藥。AS105是一種嘧啶衍生物。Rimacalib和AS105能與ATP競(jìng)爭(zhēng)同CaMKⅡ的結(jié)合,抑制CaMKⅡ的自磷酸化激活,在一定程度上也能起到抑制CaMKⅡ的作用[26]。Neef等[27－28]觀察到SMP-114和AS105能減少小鼠心室肌細(xì)胞和人心房細(xì)胞鈣火花的頻次,增加SR回收Ca2＋的能力,減少致心律失常性鈣滲漏。

4.4 其他對(duì)CaMKⅡ活性有影響的藥物

由于CaMKⅡ能被NOS氧化激活后,激活下游Nav1.5通道,INa-L的增加,胞內(nèi)鈉超載又會(huì)增加NOS生成,形成正反饋環(huán)路。Viatchenko-Karpinski等[29]用兔分離的心室肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn),INa-L抑制劑雷諾嗪能中止這一環(huán)路,降低舒張期Ca2＋濃度,減少舒張期鈣滲漏和心律失常。

5 小結(jié)

綜上所述,CaMKⅡ介導(dǎo)的Ry R2過(guò)磷酸化導(dǎo)致的鈣滲漏和INa-L過(guò)度增強(qiáng)在AMI、心衰合并心律失常以及房顫的發(fā)病中非常重要。已有很多的關(guān)于CaMKⅡ及其抑制劑的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和研究來(lái)證明抑制CaMKⅡ活性能中止心律失常的發(fā)作。但由于傳統(tǒng)CaMKⅡ抑制劑如KN-93、AIP、AC3-I的臨床應(yīng)用存在很大的局限性,因此有必要對(duì)SMP-114、AS105等新型CaMKⅡ抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步研究,以期發(fā)現(xiàn)其在心律失常防治中能起到的重要作用。