楊安康 諶晶晶 羅強 張健 楊媚 黃從新

近年來利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子構(gòu)建生物起搏,使細(xì)胞重編程為起搏樣細(xì)胞,以模擬起搏細(xì)胞表型和功能,具有不同于以往單獨轉(zhuǎn)染離子通道的優(yōu)勢。眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,如Tbx18、Tbx3、Shox2、Isl1、Nkx2.5[1]從多方面參與胚胎心臟發(fā)育分化,并構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),微妙調(diào)節(jié)心肌分化方向。不同于Tbx18、Tbx3、Shox2、Isl1等轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控起搏樣細(xì)胞發(fā)育分化,Nkx2.5主要調(diào)控工作心肌細(xì)胞發(fā)育分化,促進(jìn)相關(guān)離子通道和縫隙連接蛋白的表達(dá)。

2017年,Protze等[2]研究人員通過對發(fā)育信號通路的階段性調(diào)控,使人多功能干細(xì)胞產(chǎn)生了類竇房結(jié)樣的起搏細(xì)胞,該起搏樣細(xì)胞缺失Nkx2.5而表達(dá)了起搏標(biāo)志物,調(diào)節(jié)胚胎心臟起搏細(xì)胞發(fā)育的眾多轉(zhuǎn)錄因子如Tbx18、Tbx3、Shox2、Isl1表達(dá)水平升高,并可產(chǎn)生起搏電流,甚至移植至房室傳導(dǎo)阻滯模型大鼠心尖部位,可有效起搏周圍的組織。筆者利用RNA干擾技術(shù),將攜帶靶向Nkx2.5的RNA干擾序列短發(fā)夾RNA(sh RNA)的腺病毒(Ad)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞(NRVMs),構(gòu)建NRVMs的Nkx2.5低表達(dá)模型,以觀察下調(diào)Nkx2.5表達(dá)對乳鼠心肌細(xì)胞的影響,來探討該干預(yù)是否可以使心肌細(xì)胞重編程為起搏樣細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物:1～3天的新生SD乳鼠,雄性,由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供,動物許可證號:SCXK(鄂)2015-0018。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)、胰酶(碧云天公司),Ⅱ型膠原酶、5－溴脫氧尿嘧啶核苷,攜帶shRNA和綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒的腺病毒(深圳百恩維),大鼠超極化激活環(huán)核苷酸門控通道4型(HCN4)單克隆抗體(美國Abcam公司),HRP標(biāo)記的二抗(KPL公司),Trizol試劑(InvitrogenTM),倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(Leica公司),電泳儀、電泳槽(北京市六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 NRVMs的分離培養(yǎng) 常規(guī)方法分離培養(yǎng)NRVMs[3],將出生1～3天的新生SD乳鼠嚴(yán)格無菌操作取出心臟,使用預(yù)冷的PBS漂洗3次。將心臟剪成約1mm3的組織塊,加入8～10 ml的0.125%的胰酶,于37℃恒溫水浴鍋中震蕩消化10 min,棄上清。再加入4～5 ml含胰酶和Ⅱ型膠原酶的混合酶,消化5 min,留取上清加入同等量的完全培養(yǎng)基終止,重復(fù)上述步驟6～8次。將所得的心肌細(xì)胞懸液離心棄上清,經(jīng)70μm的分子篩過濾,接種于10 cm培養(yǎng)皿中差速貼壁90 min。收集上清,接種于6孔板內(nèi),用于后續(xù)實驗步驟。

1.2.2 鑒定心肌細(xì)胞純度 采用免疫熒光法鑒定,將培養(yǎng)的NRVMs接種于放置爬片的培養(yǎng)皿中,48 h后用PBS輕柔清洗3遍,室溫下用4%的多聚甲醛固定15 min,0.25%Triton-X100透化10min,驢血清封閉30 min后加入1∶100稀釋的一抗α-肌動蛋白(α-actin)放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜,再加入FITC標(biāo)記的二抗避光室溫孵育50 min后用DAPI 50～100 ul染色5 min,滴加適量的抗熒光淬滅劑于細(xì)胞中,蓋玻片封片,于倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)NRVMs。α-actin免疫熒光染色后,顯示綠色熒光的細(xì)胞為NRVMs,無綠色熒光的細(xì)胞表示心肌成纖維細(xì)胞或其他細(xì)胞。

1.2.3 Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP的構(gòu)建及擴(kuò)增 設(shè)計并構(gòu)建靶向Nkx2.5基因的sh RNA,將合成sh RNA克隆進(jìn)入腺病毒載體Ad-U6-CMV-GFP,得到重組腺病毒質(zhì)粒。將帶有目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a感受態(tài)菌株,將轉(zhuǎn)化后的平板挑菌,提取質(zhì)粒后酶切鑒定,用293A細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,待空斑形成后收集病毒并進(jìn)行體外純化和濃縮,直至獲得大量純化的Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP。

1.2.4 Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP的轉(zhuǎn)染 確定最適感染復(fù)數(shù)(即MOI值),將NRVMs種于12孔板內(nèi),根據(jù)MOI值0,2,5,10,20,50分別加入Ad-GFP和Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP,以不含血清的F12培養(yǎng)基定容至0.5 ml,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 h后將病毒懸液吸出,再加入1 ml不加雙抗完全培養(yǎng)基,24、48 h后熒光顯微鏡下觀察,以不引起明顯細(xì)胞病變效應(yīng)且最大轉(zhuǎn)染效率的最大MOI值為合適的感染復(fù)數(shù)。所需病毒液的體積＝細(xì)胞數(shù)×MOI/病毒滴度,經(jīng)過比較,確定本實驗的最適MOI。

本實驗將原代培養(yǎng)的NRVMs細(xì)胞隨機分為陰性對照組(NC組)和實驗組。實驗組轉(zhuǎn)染Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP,NC組轉(zhuǎn)染等量的Ad-GFP,將原代培養(yǎng)的NRVMs于六孔板培養(yǎng)48 h后,棄原培養(yǎng)基,PBS輕柔洗3遍,先加入F12無血清培養(yǎng)基定容至1 ml,按最適MOI計算的所需腺病毒量,然后輕柔混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 h后將病毒懸液吸出,再加入2 ml不含雙抗的完全培養(yǎng)基,48 h后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Nkx2.5、HCN4、縫隙連接 蛋白(Cx40)、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1 m RNA的表達(dá) 用實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測m RNA水平,轉(zhuǎn)病毒后48 h,用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,進(jìn)行q-PCR檢查。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性15 s,58℃退火20 s,72℃延伸45 s,共循環(huán)40次,以R-GAPDH作為內(nèi)參,引物見表1。

表1 各引物名稱、序列及產(chǎn)物長度

1.2.6 Nkx2.5、HCN4、Cx40、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1蛋白表達(dá) 采用蛋白質(zhì)免疫印記(Western blotting)法測定,轉(zhuǎn)病毒后48 h,提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度,根據(jù)樣品濃度確定上樣量,在樣本加入適量的5×蛋白上樣緩沖液,沸水浴5 min,制備分離膠和濃縮膠,每孔約加40 ug蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白后,將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,移入適量抗體稀釋液中4℃孵育過夜,TBST沖洗3次,使用HRP標(biāo)記的二抗于室溫下孵育30 min。暗室中曝光,顯影、定影。AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。以GAPDH為內(nèi)參作相對定量分析,實驗重復(fù)6次。

1.2.7 HCN4蛋白表達(dá)檢測 使用免疫熒光技術(shù),將原代培養(yǎng)的NRVMs種于細(xì)爬片上,貼壁48 h后隨機分為兩組分別轉(zhuǎn)染NC組和實驗組腺病毒,72 h后于室溫下使用PBS輕柔沖洗3遍,4%多聚甲醛固定15～20 min,PBS洗3遍,每次5 min。爬片稍干后,加用5%牛血清白蛋白(BSA)按1∶100稀釋好的的大鼠HCN4單克隆抗體覆蓋細(xì)胞,放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次,每次5 min,甩干后加入1∶50稀釋的CY3標(biāo)記的山羊抗大鼠的二抗室溫孵育50 min,PBS清洗3次,每次5 min,加入50～100 ul的DAPI室溫孵育5 min,滴加適量的抗熒光淬滅劑,蓋玻片封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17軟件,對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,計量資料采用±s表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的細(xì)胞觀察

剛分離的NRVMs圓形,未貼壁。24 h后可見貼壁的NRVMs,呈現(xiàn)菱形、三角形、邊界清晰銳利,出現(xiàn)單個細(xì)胞自發(fā)搏動。48 h可見其與周圍細(xì)胞形成連接,呈現(xiàn)成簇搏動,搏動頻率(102±9)次/分(n＝6)。圖1。

圖1 48 h心肌細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.2 心肌細(xì)胞純度

視野中藍(lán)色為DAPI染的細(xì)胞核,綠色熒光為NRVMs,選取6個不同視野估計純度為0.91±0.01。圖2。

圖2 α-actin免疫熒光(×200)

2.3 確定病毒轉(zhuǎn)染NRVMs的最適MOI

病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后,熒光顯微鏡下觀察,可見NC組和實驗組存活心肌呈現(xiàn)不同程度的綠色熒光,由呈現(xiàn)的綠色熒光可估計轉(zhuǎn)染效率。除MOI＝50對應(yīng)NRVMs出現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)差,大量死亡,其他MOI值對應(yīng)的細(xì)胞生長狀態(tài)尚可,可見隨著MOI的增大,轉(zhuǎn)染效率相應(yīng)增加,其中MOI＝20對應(yīng)的細(xì)胞呈現(xiàn)成片搏動,生長狀態(tài)尚佳,轉(zhuǎn)染效率約為90.84%±2.62%,依此確定最適MOI為20。圖3。

圖3 不同感染復(fù)數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)染NRVMs(×100)

2.4 基因Nkx2.5沉默效果評估

與NC組相比,實驗組相對m RNA水平下調(diào)效率60%,Nkx2.5蛋白水平亦下調(diào)(P＜0.05,表2、3、圖4)。

2.5 兩組目的基因相對表達(dá)量及蛋白表達(dá)的比較

與NC組相比,實驗組HCN4、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1表達(dá)水平升高,Cx40水平降低(P＜0.05,表2、3、圖4、5)。

表1 不同MOI值下病毒轉(zhuǎn)染效率/%

表2 兩組目的基因相對表達(dá)量比較

表3 Nkx2.5、HCN4、Cx40、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1的蛋白表達(dá)

圖4 Nkx2.5、HCN4、Cx40、Tbx3、Tbx18、Shox2、Isl1的蛋白表達(dá)

3 討論

RNA干擾是一種簡單有效的可近似代替基因敲除的工具,作用機制是與靶基因同源的雙鏈RNA被特異的核酸酶所降解產(chǎn)生小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),這些siRNA介導(dǎo)引起特異性降解目的基因的RNA,從而抑制并下調(diào)基因表達(dá)。本實驗用腺病毒包裹合成的包含shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞,可直接高效率沉默目的基因,由于細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒,對其狀態(tài)和存活都有影響,由于干擾效率也受轉(zhuǎn)染效果的影響,因此在保證轉(zhuǎn)染效率的情況下,以NC組為參照衡量病毒對目的基因Nkx 2.5的沉默效果,以構(gòu)建的病毒Ad-Nkx 2.5-sh RNA-GFP對NRVMs轉(zhuǎn)染,經(jīng)不斷摸索,轉(zhuǎn)染最佳MOI＝20,轉(zhuǎn)染48 h m RNA水平和蛋白層面均證明了該病毒的沉默效果。

圖5 兩組HCN4蛋白的表達(dá)

Nkx2.5是心臟胚胎發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,已有研究顯示Nkx2.5可抑制竇房結(jié)基因如Tbx3、Shox2和Isl1的表達(dá),而Tbx3和Shox2可以抑制Nkx2.5的表達(dá)[4－7]。本實驗在保證目的基因沉默效果后,用實時熒光PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測起搏細(xì)胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平,結(jié)果顯示這些轉(zhuǎn)錄因子水平整體上升,初步表明此時的NRVMs向起搏樣細(xì)胞分化。

竇房結(jié)頭部密集分布著起搏細(xì)胞,Wiese等[8]研究顯示在鼠胚第14.5天,Nkx2.5在竇房結(jié)頭部不表達(dá),只在竇房結(jié)尾部有少量表達(dá)。竇房結(jié)頭部的起搏細(xì)胞具有最高的自律性可產(chǎn)生起搏電流,起搏電流是起搏細(xì)胞舒張期自動除極化的重要決定因素,而HCN通道是起搏電流產(chǎn)生的重要分子基礎(chǔ),其中HCN4是竇房結(jié)中高度表達(dá)的亞型。Nkx2.5與HCN4的表達(dá)具有一定相關(guān)性,Mommersteeg等[5]研究表明胚胎發(fā)育過程中Nkx2.5抑制HCN4的表達(dá)。胚胎期肺靜脈心肌和竇角心肌具有不同的表型,當(dāng)肺靜脈心肌Nkx2.5基因不表達(dá)時,可見其表型向竇角心肌轉(zhuǎn)換,異位電活動增加,HCN4表達(dá)增加,而在工作心肌高度表達(dá)的Cx40表達(dá)減少。甚至有研究人員在分化的胚胎干細(xì)胞層面,通過siRNA沉默Nkx2.5的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HCN4水平增加[6]。本 實 驗 在Ad-Nkx2.5-sh RNA-GFP轉(zhuǎn) 染NRVMs 48 h采用實時熒光PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測細(xì)胞HCN4和Cx40水平,可見HCN4表達(dá)水平升高,Cx40表達(dá)水平降低,采用免疫熒光法檢測顯示HCN4通道蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示實驗組HCN4通道蛋白的表達(dá)明顯強于NC組,表明此時的細(xì)胞具有起搏細(xì)胞表型,證實了沉默心肌細(xì)胞Nkx2.5,從而使之重編程為起搏樣細(xì)胞的可能性。

本實驗通過差速貼壁法分離NRVMs,由于心肌細(xì)胞是不可增殖分裂細(xì)胞,分離過程中不可避免混入成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可增殖,在病毒干預(yù)之后,部分心肌細(xì)胞因病毒作用死亡,成纖維細(xì)胞可分裂增殖取代原有心肌細(xì)胞空間,進(jìn)而可造成心肌純度下降,在提取m RNA和蛋白時,可能影響實驗結(jié)果,致使檢測的變化不及應(yīng)有的水平。