林 潔 ，許惠鳳 ，陳 俊 ，葉錦霞 ，鄭春松 ，王麗麗 ，張世茂 ，吳廣文

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建省祥興電子科技有限公司，福建 寧德 352300）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是中老年人常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病之一，臨床癥狀表現(xiàn)為疼痛、僵硬、活動(dòng)受限等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1-2］。隨著醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，KOA的病因、機(jī)制等相關(guān)研究取得了一定進(jìn)展，但治療上仍未有突破性成果［3-4］。本研究擬觀察智能治療儀對(duì)兔KOA關(guān)節(jié)軟骨組織的形態(tài)變化、蛋白多糖及關(guān)節(jié)液中白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）-3、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的影響，探究智能治療儀對(duì)KOA的作用及可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔64只，體質(zhì)量為（2.1±1.0）kg，雌雄各半，購(gòu)于上海松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0011。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的普通級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司）；HE染色試劑盒（北京索萊寶生物有限公司）；改良番紅O-固綠試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；IL-1β試劑盒、IL-6試劑盒、TNF-α試劑盒、MMP-3試劑盒、HA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 智能治療儀（福建省祥興電子科技有限公司）；G6805-2A低頻電子脈沖治療儀（上海華誼醫(yī)用儀器有限公司）；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、生物組織石蠟包埋機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將64只新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白組（n＝16）和造模組（n＝48）。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后，造模組采用改良 Hulth法［5-6］建立KOA模型，空白組未進(jìn)行任何操作。術(shù)后對(duì)造模組肌肉注射20萬(wàn)單位青霉素，每日2次，連續(xù)注射3 d。術(shù)后1周，強(qiáng)迫所有動(dòng)物進(jìn)行活動(dòng)30 min，每日1次，連續(xù)8周或16周。

2.2 分組及干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模組分為模型組、對(duì)照組和治療組各16只。干預(yù)在改良Hulth手術(shù)后1周進(jìn)行，每組隨機(jī)分2批，干預(yù)時(shí)間分別為8周和16周。對(duì)照組予低頻電子脈沖治療儀干預(yù)，每次30 min，每日2次；治療組予智能治療儀干預(yù)，每次30 min，每日2次；空白組和模型組均不進(jìn)行任何治療。

2.3 動(dòng)物取材和標(biāo)本制備 干預(yù)8周和16周后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉兔子，麻醉成功后，用5 mL醫(yī)用注射器針頭于髕韌帶附著點(diǎn)外上方處穿刺入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注入滅菌鹽水1.5 mL后反復(fù)活動(dòng)膝關(guān)節(jié)30次，抽取關(guān)節(jié)液，置入EP管中，－80℃保存?zhèn)溆?。打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔，取脛骨平臺(tái)外側(cè)軟骨組織，快速置于4%中性多聚甲醛中固定2 d，經(jīng)過(guò)10%EDTA-2NA脫鈣2個(gè)月，再進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯和石蠟置換，用石蠟進(jìn)行包埋。取脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨組織，在低溫環(huán)境下修成約1 mm×1 mm×3 mm大小，經(jīng)過(guò)前固定、后固定、樹(shù)脂包埋和聚合形成電鏡標(biāo)本。

2.4 軟骨組織病理 將包埋塊切成4 μm的切片，貼附于粘附載玻片，置于60℃烘箱過(guò)夜。HE染色：經(jīng)過(guò)二甲苯、梯度酒精脫蠟入水后，置于蘇木素染液 1 min，蒸餾水漂洗5 min，伊紅染色 1 s，蒸餾水漂洗5 min。改良番紅O-固綠染色：脫蠟入水后用Weigert染液（現(xiàn)配現(xiàn)用）染色5 min，酸性乙醇分化15 s，再用固綠染液染色5 min后蒸餾水洗1 min，用番紅O染色3 min，蒸餾水洗1 min。乙酸溶液分色2 min，蒸餾水洗30 s后，將切片晾干，中性樹(shù)脂封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄軟骨組織形態(tài)及蛋白多糖含量。

2.5 電鏡觀察 樹(shù)脂包埋塊以1 μm進(jìn)行半薄切片定位后，再以90 nm進(jìn)行超薄切片。超薄切片進(jìn)行醋酸鈾-檸檬酸鉆染色后，置于透射電鏡下觀察big記錄軟骨組織超微結(jié)構(gòu)。

2.6 軟骨組織Mankin’s評(píng)分 根據(jù)HE染色和改良番紅O－固綠染色的光鏡結(jié)果，參照Mankin’s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行評(píng)估軟骨組織病程變化。Mankin’s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：軟骨組織結(jié)構(gòu)（正常0分、表面不平整1分、裂隙達(dá)移行層2分、裂隙達(dá)輻射層3分、裂隙達(dá)鈣化層4分、軟骨脫落5分）；軟骨細(xì)胞數(shù)量（正常0分、增多1分、成簇狀2分、減少3分）；改良番紅O-固綠染色（正常0分、輕度失染1分、中度失染2分、重度失染3分、完全失染4分）；潮線（完整0分、多重1分、軟骨下骨血管入侵潮線2分）。

2.7 關(guān)節(jié)液 IL-lβ、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA 含量測(cè)定 取出－80℃保存?zhèn)溆玫年P(guān)節(jié)液，按照試劑盒說(shuō)明書步驟，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA 含量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以（）表示；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位值（第一四分位數(shù)，第三四分位數(shù)）表示。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 實(shí)驗(yàn)完成情況 本實(shí)驗(yàn)對(duì)象原為64只新西蘭大白兔，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因造模麻醉過(guò)量致死1只和因腹瀉致死2只。

3.2 軟骨組織顯微結(jié)構(gòu) 軟骨組織HE染色和改良番紅O-固綠染色見(jiàn)圖1～2，8周和16周的空白組：關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，淺表層、移行層、輻射層、鈣化層4層結(jié)構(gòu)清晰可辨，軟骨細(xì)胞排列規(guī)則，潮線完整，軟骨基質(zhì)淺紫紅色。8周和16周的模型組：關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，軟骨層變薄，4層結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞呈簇狀且數(shù)量減少，潮線多重或不完整或完全消失，軟骨下骨侵入軟骨層，軟骨基質(zhì)番紅O染色嚴(yán)重失染。8周和16周的對(duì)照組和治療組關(guān)節(jié)軟骨表面稍不規(guī)則，4層結(jié)構(gòu)仍可區(qū)分，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多或呈簇狀，潮線復(fù)制，軟骨下骨有侵入軟骨組織傾向，軟骨基質(zhì)番紅O染色失染表現(xiàn)。各組軟骨組織在8周的顯微結(jié)構(gòu)情況較16周好。

3.3 軟骨組織不同干預(yù)時(shí)間Mankin’s評(píng)分比較見(jiàn)表1。

3.4 軟骨組織超微結(jié)構(gòu) 8周和16周的空白組：軟骨細(xì)胞形狀規(guī)則，周圍見(jiàn)有胞突，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體豐富，糖原散在分布，膠原原纖維較細(xì)且密集。8周和16周的模型組：軟骨細(xì)胞形狀較不規(guī)則，周圍胞突減少，胞核變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成池或減少，高爾基體、線粒體固縮不易識(shí)別，糖原減少，部分細(xì)胞呈變性、壞死狀態(tài)，膠原原纖維減少。8周和16周的對(duì)照組和治療組：軟骨細(xì)胞形狀稍不規(guī)則，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及高爾基體結(jié)構(gòu)較模型組好，糖原稍減少，膠原原纖維稍稀疏。

3.5 不同干預(yù)時(shí)間關(guān)節(jié)液中 IL-lβ、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA的含量比較 見(jiàn)表2。

4 討 論

KOA 屬中醫(yī)“痹證”“痿證”范疇［8］。KOA 的治療方式多樣，其中包括了電刺激物理治療，智能治療儀正是屬于其中一種［9］。智能治療儀在神經(jīng)電理論基礎(chǔ)上研發(fā)而來(lái)，治療時(shí)結(jié)合中醫(yī)經(jīng)絡(luò)穴位理論，通過(guò)對(duì)相關(guān)穴位的刺激以達(dá)疏經(jīng)通絡(luò)、行氣活血之功，從而達(dá)到治療KOA的作用。

圖1 軟骨組織HE染色圖（×100）

圖2 軟骨組織改良番紅O-固綠染色圖（×50）

表1 軟骨組織不同干預(yù)時(shí)間Mankin's評(píng)分比較

KOA的病理變化包括軟骨組織退變、軟骨下骨硬化、骨贅增生、滑膜炎癥、周圍韌帶松弛、肌肉萎縮等，其中最核心病理特征為軟骨組織退變［10-11］。盡管骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）曾被認(rèn)為是一種非炎性疾病，但是炎癥反應(yīng)存在于疾病進(jìn)程中已越來(lái)越被認(rèn)可［12］。HA是關(guān)節(jié)滑液成分之一，具有潤(rùn)滑、滋養(yǎng)、緩沖壓力等作用，有研究報(bào)道KOA患者滑液中HA濃度明顯降低，其降低的原因可能與炎癥、滑膜異常等密切相關(guān)［13-14］?，F(xiàn)較為明確的是，除力學(xué)刺激外，相關(guān)生物分子參與KOA病理發(fā)生發(fā)展中，如 IL-1β、IL-6、TNF-α、MMPs 等［15］。 細(xì)胞因子由多種細(xì)胞分泌，且具有調(diào)節(jié)和介導(dǎo)免疫和炎癥的作用，參與 OA 的發(fā)生發(fā)展中［16］，如 IL-1β、IL-6、TNF-α均在OA患者滑液中表達(dá)增加且與病情程度呈正相關(guān)［17-18］。在OA中，IL-1β能刺激軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞生成MMPs、一氧化氮、前列腺素E等，IL-6影響軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞增生且刺激IL-1、MMPs形成，TNF-α參與軟骨與骨的損傷且促進(jìn)前列腺素E、MMPs等生成，三者均參與炎癥反應(yīng)過(guò)程［19-20］。MMP是多種具有相似結(jié)構(gòu)蛋白酶構(gòu)成的大家族，可分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素等，能降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種成分，與OA疾病密切相關(guān)［21］。例如，MMP-3可直接降解多種膠原、蛋白多糖、纖連蛋白等，在OA的關(guān)節(jié)液、血清、軟骨中能檢測(cè)到MMP-3 表達(dá)增高［22-24］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明改良Hulth法建立兔KOA模型較為穩(wěn)定，軟骨組織退變明顯，手術(shù)后16周的軟骨組織損傷情況對(duì)比8周明顯加重。智能治療儀和電子脈沖治療儀均能改善軟骨組織退變，抑制蛋白多糖降解，在干預(yù)8周時(shí)，兩者治療效果相當(dāng)，但是在干預(yù)16周時(shí)，智能治療儀的效果優(yōu)于電子脈沖治療儀。與治療8周相比，治療16周后，模型組、治療組和對(duì)照組中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3含量均進(jìn)一步升高，HA含量進(jìn)一步降低，表明關(guān)節(jié)炎仍然處于進(jìn)展過(guò)程，但對(duì)照組和治療組IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3含量升高幅度與HA降低幅度均低于模型組，說(shuō)明智能治療儀和低頻電子脈沖治療儀雖無(wú)法完全阻斷KOA疾病進(jìn)程，但可起到延緩疾病進(jìn)程的作用。同一療程中，治療組與對(duì)照組IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3 與 HA 的含量比較不存在差異，說(shuō)明智能治療儀在調(diào)節(jié)這些分子的作用與低頻電子脈沖治療儀相當(dāng)。另外，因智能治療儀攜帶、使用方便，有利于隨時(shí)隨地使用，值得臨床進(jìn)一步推廣。

表2 不同干預(yù)時(shí)間關(guān)節(jié)液中IL-lβ、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA含量比較ng／mL