王 林，施 紅，張捷平，鄭雪花，王曉寧

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者表現(xiàn)為慢性低度炎癥反應(yīng)，而慢性炎癥的發(fā)生與糖尿病過(guò)程中多種炎癥因子，尤其是脂肪細(xì)胞因子表達(dá)分泌紊亂有密切關(guān)系。脂肪細(xì)胞因子不僅在脂肪組織表達(dá)分泌，在其他靶器官如肝臟、腎臟中也有表達(dá)，在正常情況下參與血糖、血脂水平的調(diào)節(jié)和代謝，其表達(dá)分泌異常在糖尿病的發(fā)生及病情的進(jìn)展發(fā)揮重要作用［1-2］。脂肪細(xì)胞因子內(nèi)脂素（visfatin）是糖尿病發(fā)病與病情進(jìn)展的重要相關(guān)細(xì)胞因子［3］。目前研究認(rèn)為其是糖尿病發(fā)生的獨(dú)立相關(guān)因素，也在糖尿病并發(fā)癥包括肝臟損害、糖尿病腎病的發(fā)生與進(jìn)展中扮演了重要作用。我們采用石斛合劑治療2型糖尿病患者，發(fā)現(xiàn)其有降低血糖、調(diào)整血脂、改善胰島素抵抗、促胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）分泌、促胰島β細(xì)胞增殖的作用［4-6］，對(duì)糖尿病慢性炎癥反應(yīng)有改善作用，對(duì)糖尿病時(shí)靶器官有保護(hù)作用［7-9］。本研究通過(guò)觀察石斛合劑對(duì)糖尿病模型大鼠visfatin表達(dá)的影響，分析其對(duì)糖尿病時(shí)慢性炎癥狀態(tài)改善作用及對(duì)靶器官保護(hù)作用的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，合格證號(hào)：0073141，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 石斛合劑（組方包含石斛、生地黃、黃芪、丹參）由福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂提供；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）；微量血糖檢測(cè)儀及血糖檢測(cè)試紙（上海復(fù)旦大學(xué)張江生物醫(yī)藥股份有限公司）；Trizol試劑、M-MLV Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；Perfect Real Time-SYBR Premix EX Taq Kit實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）；visfatin ELISA檢測(cè)試劑盒、抗體（英國(guó)Abcam公司）；免疫印跡RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；甘油三酯（TC）、總膽固醇（TG）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170430、20170515）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 Stratos高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國(guó)公司）；DU730分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；Gel Doc XR凝膠電泳成像檢測(cè)分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；DYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀（北京市六一儀器廠）；ULT-1386-5V超低溫冰箱（賽默飛世爾科技中國(guó)公司）；Epgradient S實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf基因有限公司）；BIO-RAD蛋白電泳儀器［伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］；快速血糖檢測(cè)儀（德國(guó) Roche公司）；Beckman X20自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 石斛合劑藥液制備 石斛、黃芪、丹參、生地黃等中藥水煎。購(gòu)買藥材加入1000 mL蒸餾水中，浸泡30 min，大火煮沸10 min后，小火煎煮20 min，濾出藥液。水煎2次，所得藥液混合后濃縮，濃縮至1.2 g／mL生藥量濃度。

2.2 動(dòng)物造模 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，自由攝食攝水，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣抽簽法，選取6只為正常組，余24只為造模組。正常組進(jìn)食普通混合飼料，造模組進(jìn)食高脂高糖飼料（配方為普通混合飼料88.5%、豬油10%、膽固醇 1%、膽酸鈉0.5%）。飼養(yǎng)4周后造模組禁食12 h，鼠尾采血檢測(cè)血糖后，予鏈脲佐菌素腹腔注射，用量為30 mg／kg體重，注射后喂食普通混合飼料。注射后第3天，禁食12 h，鼠尾采血測(cè)血糖，空腹血糖水平≥11.1 mmol／L為糖尿病模型大鼠。其中1只死亡，4只未成模，成模19只。

2.3 動(dòng)物分組及給藥 選取12只造模組大鼠隨機(jī)分為模型組和石斛合劑組各6只，石斛合劑組予石斛合劑藥液按 12 g／（kg·d）進(jìn)行灌胃，模型組和正常組予等量生理鹽水灌胃，共灌胃干預(yù)8周。

2.4 取材 末次給藥后次日禁食，鼠尾取血，血糖檢測(cè)儀快速檢測(cè)血糖。30%烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心后分離血清，4℃?zhèn)溆谩z測(cè)血生化指標(biāo)及血清visfatin水平。取大鼠內(nèi)臟脂肪組織、肝臟、腎臟液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 觀察指標(biāo)及方法

2.5.1 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)3組大鼠空腹血糖及血清中TG、TC含量，并采用ELISA法檢測(cè)血清中visfatin水平。

2.5.2 組織visfatin mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 取大鼠內(nèi)臟脂肪、肝臟、腎臟組織樣本各30 mg，以液氮碾磨后采用Trizol試劑提取各組織總RNA。檢測(cè)各樣本提取RNA的OD260／OD280比值，分析計(jì)算總RNA純度和濃度。每樣品取5 μg總RNA，使用qRTPCR試劑盒采用 Oligo（dT）20引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。應(yīng)用Prime5.0軟件設(shè)計(jì)引物，visfatin：正向引物5'-TCTGGAAATCCGCTCGACAC-3'，反向引物5'-AGTAAGTTCCCCTGCCTCAC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度129 bp。 β-actin：正向引物 5'-ATTGTGATGGACTCCGGAGA-3'，反向引物5'-CTCGTCAGGATCTTCATGA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度136 bp。反應(yīng)體系：2×SYBR 12.5 μL，10 μmol／L 正向、反向引物各 0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至體積 25 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；55～60 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s；共45個(gè)循環(huán)。融解曲線分析：溫度60～95℃，每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3次。以β-actin作為內(nèi)參，以相對(duì)表達(dá)量2-△△Ct來(lái)表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5.3 組織visfatin蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 取大鼠內(nèi)臟脂肪、肝臟、腎臟各樣本組織30 mg，加入液氮碾磨，采用RIPA裂解液裂解后提取蛋白，BCA法檢測(cè)各樣品上清液蛋白濃度。取50 μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，室溫以5%脫脂牛奶封閉。加入一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，以TBST洗膜，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，充分洗滌后顯影。 以βactin作為內(nèi)參，采用美國(guó)Flour ChemV 2.0凝膠成像分析軟件，掃描蛋白電泳條帶的灰度值，進(jìn)行定量分析，結(jié)果以目的蛋白灰度／內(nèi)參β-actin灰度比值表示。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用One-Way ANOAY方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson簡(jiǎn)單相關(guān)分析。

3 結(jié) 果

3.1 3組大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比較 見(jiàn)表1。血清visfatin水平與血糖水平相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。Pearson相關(guān)分析顯示r＝0.767，P＝0.002，血糖水平與血清visfatin水平呈正相關(guān)。

表1 3組大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比較（）

表1 3組大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑組鼠數(shù)666空腹血糖 ／（mmol／L）5.06±0.85 30.31±3.561）18.41±5.531）2）TG／（mmol／L）0.85±0.09 1.92±0.211）1.46±0.151）2）TC／（mmol／L）1.13±0.16 2.23±0.311）1.61±0.201）2）血清 visfatin／（pg／mL）137.17±10.94 210.67±22.321）168.52±15.631）2）

圖1 血清visfatin水平與血糖水平關(guān)系散點(diǎn)圖

3.2 3組大鼠不同組織visfatin mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。

3.3 3組大鼠不同組織visfatin蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)圖 2、表 3。

表2 3組大鼠不同組織visfatin mRNA表達(dá)水平比較（）

表2 3組大鼠不同組織visfatin mRNA表達(dá)水平比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑組n666內(nèi)臟脂肪1.02±0.09 4.40±0.511）2.41±0.791）2）肝臟1.02±0.14 2.53±0.551）1.57±0.281）2）腎臟0.96±0.10 2.04±0.521）1.59±0.191）2）

圖2 3組大鼠不同組織visfatin蛋白表達(dá)電泳圖

表3 3組大鼠不同組織visfatin蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 3組大鼠不同組織visfatin蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑組n666內(nèi)臟脂肪0.38±0.11 0.85±0.111）0.53±0.141）2）肝臟0.43±0.09 0.64±0.121）0.45±0.091）2）腎臟0.51±0.80 0.74±0.141）0.52±0.171）2）

4 討 論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病早期發(fā)病機(jī)理是陰虛燥熱。陰津虧耗致燥熱偏盛，燥熱盛則陰津虛，兩者互為因果。如不及時(shí)恰當(dāng)治療，病程遷延陰損耗氣，而致氣陰兩虛。臟腑功能失調(diào)，津液代謝障礙，氣血運(yùn)行受阻，痰濁瘀血內(nèi)生，全身脈絡(luò)瘀阻，臟腑器官失去氣血滋養(yǎng)引起多器官病變。若病程遷延日久或因治療失當(dāng)，陰損及陽(yáng)，終致陰陽(yáng)俱虛。石斛合劑滋陰清熱、益氣活血，兼以疏肝解郁、清肝泄?jié)?，能解除病況中的陰虛、氣虛、血瘀狀況，改善臟腑狀態(tài)。前期的研究證實(shí)其能顯著調(diào)整血糖、血脂水平［4-6］。

visfatin是一種與血糖調(diào)節(jié)有關(guān)的重要細(xì)胞因子，在人和動(dòng)物的脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌、腎臟等均有表達(dá)，其可通過(guò)提高脂肪和肌肉組織葡萄糖攝取能力，降低肝糖原的釋放來(lái)影響血糖水平，調(diào)節(jié)糖代謝。還能直接與胰島素受體結(jié)合，激活胰島素調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞糖代謝的相關(guān)信號(hào)通路，有類胰島素樣作用［10］。近年來(lái)不少研究證實(shí)，visfatin與糖尿病之間有著密切的關(guān)系。Alghasham等［11］研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)并發(fā)癥的糖尿病患者血visfatin含量明顯高于非糖尿病組和有并發(fā)癥的患者。Chen等［12］用酶免法測(cè)量了61名糖尿病患者和 59名健康對(duì)照者血漿visfatin含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常人對(duì)比，糖尿病患者血漿visfatin含量顯著升高，且與體脂含量成正相關(guān)，提示visfatin的表達(dá)與血糖水平改變及機(jī)體脂肪代謝有關(guān)，這可能是調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制之一，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)以糖尿病模型大鼠為研究對(duì)象，觀察石斛合劑灌胃后大鼠內(nèi)臟脂肪、肝臟、腎臟中visfatin的水平變化。檢測(cè)到石斛合劑組與模型組比較，組織中visfatin表達(dá)量顯著下降，且與血糖變化水平呈現(xiàn)正相關(guān)，說(shuō)明石斛合劑可以改善多組織中的visfatin的表達(dá)，達(dá)到降糖效果，其作用具有多環(huán)節(jié)、多靶器官特點(diǎn)。另外目前研究認(rèn)為2型糖尿病是由炎癥因子介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，visfatin也是重要的促炎癥因子，其在糖尿病慢性炎癥發(fā)展過(guò)程中也起重要作用［13］。石斛合劑降低組織中visfatin的表達(dá)可改善組織器官慢性炎癥狀態(tài)，提示了石斛合劑對(duì)糖尿病慢性器官病變的作用，而慢性炎癥狀態(tài)與血糖水平的變化將是接下來(lái)研究的內(nèi)容。本研究為石斛合劑降糖作用及其對(duì)靶器官的保護(hù)作用提供了理論支持。