傅珊珊,汪慶玲,譚春江
(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建 福州350122)
慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)作為嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病之一,是多因素相互作用的復(fù)雜病理過程。盡管近年來在防治CHF方面取得很大進(jìn)展,但致殘率及死亡率仍然居高不下[1]。研究發(fā)現(xiàn),腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)過度激活,參與 CHF的病理生理過程,也在水鈉潴留、心肌重塑以及CHF發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。中醫(yī)藥防治CHF積累了幾千年的經(jīng)驗(yàn),單獨(dú)運(yùn)用中藥或者聯(lián)合西藥治療CHF,無論是近期療效還是遠(yuǎn)期療效、患者的預(yù)后、生活質(zhì)量等方面,均有較好的改善[3-4]。心水通膠囊(XST)是譚春江導(dǎo)師多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方,由太子參、黃芪、丹參、桂枝等組成,具有溫補(bǔ)心陽、活血祛瘀、行氣利水之功。前期臨床研究發(fā)現(xiàn),XST能有效改善患者心功能和提高生活質(zhì)量[5],但其作用機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)擬采用腹腔注射阿霉素構(gòu)建CHF大鼠模型,探討XST對CHF大鼠RAAS系統(tǒng)活性的影響,進(jìn)而探討其作用機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性Wistar大鼠48只,體質(zhì)量(200.00±20.19)g,由福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供,動物許可證號:SCXK(滬)2012-0002,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理學(xué)委員會要求執(zhí)行。
1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 心水通中藥復(fù)方組成藥材的中藥飲片,由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房提供。按照該組方的中藥配方比例,將總質(zhì)量為2 200 g的中藥飲片反復(fù)水煎煮2次,過濾,合并收集濾液轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,將其濃縮至952 mL,每1 mL藥液含生藥2.31 g,備用??ㄍ衅绽ㄈA中藥業(yè)股份有限公司,批號:20170403);阿霉素(凱基生物有限責(zé)任公司,批號:20180525)。
1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 大鼠腎素試劑盒、大鼠血管緊張素Ⅱ試劑盒、大鼠醛固酮試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司,批號:MB-1884A、MB-1752A、MB-2096A);Infinite M2000多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN集團(tuán)公司);VeVo2100高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(美國富士公司);7500全自動生化分析儀(日本日立公司)。
2.1 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將Wistar大鼠分為正常組8只和造模組40只。將阿霉素用超純水渦旋溶解,造模組按大鼠體質(zhì)量1.25 mg/kg予阿霉素腹腔注射,每周2次,共注射6周,心臟彩超檢測左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<50%確認(rèn)為CHF模型構(gòu)建成功;正常組給予等體積生理鹽水腹腔注射。
2.2 干預(yù) 造模成功的大鼠,隨機(jī)分為模型組、卡托普利組和XST低、中、高劑量組各8只;卡托普利組按 2.625 mg/(kg·d)予卡托普利混懸液灌胃(相當(dāng)于成人臨床等效劑量);XST低、中、高劑量組分別按 4.95、9.9、19.8 g/(kg·d)予 XST 水提液灌胃,相當(dāng)于成人臨床等效劑量0.5倍、1倍、2倍;正常組、模型組予等體積蒸餾水灌胃。各組每日灌胃1次,連續(xù)干預(yù)4周。
2.3 取材 給藥4周后,于取材前1天,各組大鼠禁食不禁水,收集24 h尿液,3 500 r/min離心15 min,取澄清液,于-20℃冰箱保存待測。取材時,10%水合氯醛按3 mL/kg麻醉大鼠,仰臥位固定后剪開腹壁,打開腹腔,進(jìn)行腹主動脈采血,將血樣靜置30 min后,3 500 r/min 離心 15 min,收集上清液,于-20 ℃冰箱保存待測。
2.4 觀察指標(biāo)及方法
2.4.1 心臟超聲心動圖檢測 造模后檢測大鼠超聲心動圖參數(shù)情況。具體操作:予10%水合氯醛按3 mL/kg麻醉大鼠,仰臥位固定于鼠板上,胸部脫毛備皮后,使用線陣探頭取左室長軸切面和左室短軸切面測量M2型曲線,連續(xù)測3個心動周期的左心室內(nèi)徑(LVID)、室間隔厚度(IVS)、左心室后壁厚度(LVPW),取其平均值,經(jīng)分析軟件計(jì)算出左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),以LVEF<50%為模型構(gòu)建成功。
2.4.2 血清指標(biāo)檢測 采用ELISA法檢測血清腎素(Renin)、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、醛固酮(ADS)含量,按試劑盒說明書步驟操作。采用全自動生化分析儀檢測血清中電解質(zhì)及肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。
2.4.3 尿液檢測 應(yīng)用全自動生化分析儀檢測尿液中電解質(zhì)及總蛋白(TP)含量。
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以()表示,采用單因素方差分析,當(dāng)方差齊性時,兩兩比較采用LSD法;方差不齊則采用Games-Howell法。
3.1 動物死亡情況 實(shí)驗(yàn)過程中模型組死亡2只,低劑量組死亡1只,解剖探查未發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的死亡原因。
3.2 6組大鼠LVEF變化情況比較 見表1。
表1 6組大鼠LVEF變化情況比較()%
表1 6組大鼠LVEF變化情況比較()%
注:與正常組比較,1) P<0.05;與模型組比較,2) P<0.05。
組別正常組模型組卡托普利組XST低劑量組XST中劑量組XST高劑量組n868788造模前82.13±3.24 80.56±4.22 79.67±8.75 82.73±2.45 79.23±3.98 81.38±6.39造模后80.14±6.72 48.24±3.791)49.84±5.561)48.26±9.731)47.39±4.571)50.32±5.301)給藥4周80.26±3.36 41.29±10.841)47.42±8.791)2)43.22±5.931)44.35±8.091)2)48.52±3.371)2)
3.3 6組大鼠體質(zhì)量變化情況比較 見表2。
表2 6組大鼠體質(zhì)量變化情況比較()g
表2 6組大鼠體質(zhì)量變化情況比較()g
注:與正常組比較,1) P<0.05;與模型組比較,2) P<0.05。
組別正常組模型組卡托普利組XST低劑量組XST中劑量組XST高劑量組n868788造模前265±9 256±12 272±16 268±14 262±13 264±17造模后343±24 279±231)285±21 283±29 271±20 282±23給藥2周364±25 319±171)305±201)2)305±161)2)301±331)2)291±201)2)給藥4周393±22 322±141)305±191)2)307±171)2)305±261)2)299±141)2)
3.4 6 組血清 Renin、Ang Ⅱ、ADS、CK、CK-MB 含量比較 見表3。
表3 6 組大鼠血清 Renin、Ang Ⅱ、ADS、CK、CK-MB 含量比較()
表3 6 組大鼠血清 Renin、Ang Ⅱ、ADS、CK、CK-MB 含量比較()
注:與正常組比較,1) P<0.01;與模型組比較,2) P<0.05;與 XST 低劑量組比較,3) P<0.05。
組別正常組模型組卡托普利組XST低劑量組XST中劑量組XST高劑量組n868788 Renin/(ng/mL)128.63±32.52 1946.32±642.341)238.11±29.131)2)929.33±96.121)2)607.36±29.321)2)405.41±112.901)2)3)Ang Ⅱ /(ng/mL)58.34±22.94 370.73±98.011)96.76±7.251)3)201.72±23.651)2)154.62±8.961)2)117.41±10.572)ADS/(pg/mL)145.42±7.12 1449.61±288.831)207.64±29.811)2)3)376.16±53.441)2)288.67±10.861)2)251.61±2.671)3)CK/(U/L)779.41±85.43 2971.53±153.461)1245.61±127.091)2)2565.57±67.281)2)2148.75±21.482)1705.38±202.572)CK-MB/(U/L)1157.90±143.37 4398.66±140.151)1587.54±66.011)2)3)3409.80±457.341)2)2889.51±108.761)2242.82±334.312)3)
3.5 6 組大鼠血清 K+、Na+、Cl-、Cr、BUN 含量比較見表4。
3.6 6 組大鼠尿量以及尿 K+、Na+、Cl-、TP 含量比較 見表5。
CHF是一種復(fù)雜的臨床癥狀群,是多種心臟疾病的終末階段,可引起利尿劑抵抗、心臟容量負(fù)荷過度及進(jìn)行性腎功能損害,進(jìn)而發(fā)展為“心腎綜合征”,最終導(dǎo)致心力衰竭進(jìn)一步惡化,多種并發(fā)癥蜂起[6]。
RAAS過度激活,是CHF發(fā)生及發(fā)展的重要神經(jīng)體液調(diào)控系統(tǒng)之一[7]。研究表明,心力衰竭時由于心排血量降低、腎血流量減少,會過度激活RAAS系統(tǒng)。CHF時交感神經(jīng)興奮,刺激腎素分泌增加,而腎素又作用于血管緊張素原,刺激合成AngⅡ。AngⅡ和ADS的異常增多導(dǎo)致血管收縮、鈉水潴留,加重心臟的壓力負(fù)荷及容量負(fù)荷,使心臟負(fù)擔(dān)加重,同時促進(jìn)心肌和血管平滑肌的重塑,最終導(dǎo)致心功能不斷惡化。干預(yù)RAAS的過度激活,是防治CHF的重要方法之一,也是評價CHF病情轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的重要指標(biāo)[6]。
表4 6 組大鼠血清 K+、Na+、Cl-、Cr、BUN 含量比較()mmol/L
表4 6 組大鼠血清 K+、Na+、Cl-、Cr、BUN 含量比較()mmol/L
注:與正常組比較,1) P<0.05;與模型組比較,2) P<0.05。
組別正常組模型組卡托普利組XST低劑量組XST中劑量組XST高劑量組n868788 K+9.23±0.31 5.13±0.251)6.37±0.261)5.89±0.301)7.63±0.35 8.76±0.25 Na+143.51±0.56 138.34±0.541)140.01±0.38 140.25±0.20 141.49±0.16 142.02±0.24 Cl-103.30±0.96 97.03±1.731)101.29±0.21 98.27±0.58 101.37±0.58 102.56±0.32 Cr 32.95±1.90 47.73±4.20 35.73±0.592)43.60±1.612)40.17±0.212)38.73±0.872)BUN 4.66±0.24 7.79±0.44 5.53±0.322)6.96±0.152)6.42±0.242)6.01±0.012)
表5 6 組大鼠尿量以及尿 K+、Na+、Cl-、TP 含量比較()
表5 6 組大鼠尿量以及尿 K+、Na+、Cl-、TP 含量比較()
注:與模型組比較,1) P<0.05。
組別正常組模型組卡托普利組XST低劑量組XST中劑量組XST高劑量組n868788尿量/mL 16±21)9±2 13±31)11±41)11±31)12±41)K+/(mmol/L)117.92±1.521)136.94±9.73 107.52±3.251)93.66±5.341)96.85±3.461)101.84±1.151)Na+/(mmol/L)37.51±2.00 40.21±1.39 35.37±1.67 28.46±3.471)30.20±0.741)32.21±2.811)Cl-/(mmol/L)60.08±3.35 64.57±2.71 48.95±3.621)57.32±1.481)54.64±2.281)51.83±1.911)TP/(mmol/L)4.76±0.14 46.85±5.98 5.73±0.661)30.14±4.711)18.02±2.821)10.31±2.461)
CHF屬于中醫(yī)學(xué)“心水病”的范疇,心水病的病理過程涉及心與腎的功能變化,最終導(dǎo)致心腎同病,從而影響陰陽、氣血、津液的正常代謝。因此,溫陽益氣、活血利水是防治慢性心力衰竭的基本方法,臨床證實(shí)該治療方法具有良好的效果。課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,XST水提物能增加缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞超氧化物歧化物,減少丙二醛和乳酸脫氫酶含量,提示XST水提物對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用,且細(xì)胞毒性?。?,12]。 臨床研究 發(fā)現(xiàn),XST對CHF利尿劑抵抗患者有明顯的利尿的作用,能改善患者的心功能和癥狀,且不良反應(yīng)少[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該藥物能夠干預(yù)腎小管中水通道蛋白-2,抑制水分重吸收,達(dá)到利尿效果,改善機(jī)體鈉水潴留癥狀[9-11]。
本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:給藥前較給藥后對LVEF影響情況,XST高、中劑量組及卡托普利組前后對照不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,較模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示XST水提液可改善心室收縮功能,延緩CHF病程發(fā)展。不同劑量的XST能不同程度抑制腎素、血管緊張素、醛固酮水平的升高,提示XST水提液能抑制慢性心衰大鼠RAAS系統(tǒng)過度激活。XST能明顯增加CHF大鼠的尿量,且不影響血清和尿液電解質(zhì)。此外,XST能降低血Cr和BUN的水平,XST還能劑量依賴性減少血清CK和CKMB含量,提示XST能減少心肌細(xì)胞的損傷,改善腎功能,延緩CHF病程發(fā)展。
本課題組前期對XST水提物進(jìn)行藥效學(xué)和毒理學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)該藥物在增加小鼠尿量的同時,對尿液性質(zhì)和血電解質(zhì)未見不良影響,對心肝腎功能以及心、肝、脾、肺、腎等病理學(xué)組織也未發(fā)現(xiàn)異常改變[10],在本次實(shí)驗(yàn)研究中也得到再次驗(yàn)證。而本次實(shí)驗(yàn)從RAAS研究XST的作用機(jī)制,明確了XST對腎素、血管緊張素Ⅱ和醛固酮具有抑制作用,是前期實(shí)驗(yàn)的繼續(xù),進(jìn)一步完善XST的作用機(jī)制。