肺動脈高壓(PAH)是多種心肺血管疾病的重要病理基礎。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Warburg效應通過促進肺動脈平滑肌細胞(PASMC)異常增殖在PAH發(fā)生發(fā)展中起重要作用，阻斷Warburg效應可改善PAH[1-3]。沉默信息調節(jié)因子3(SIRT3)是主要的線粒體去乙?；?，通過去乙?；{節(jié)線粒體中多種糖代謝酶的活性，促進葡萄糖氧化磷酸化，在調節(jié)葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用，其表達或活性下調可導致葡萄糖代謝途徑的改變[4]。本研究擬探討野百合堿(MCT)誘導PAH大鼠(MCT-PAH大鼠)模型SIRT3表達的變化及是否存在Warburg效應，為研究Warburg效應在PAH中的作用及可能的觸發(fā)機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

健康清潔級2月齡SD雄性大鼠16只購自南華大學動物部[許可證號為SCXK(湘)2015-0002]。MCT購自美國Sigma公司；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天生物研究所；二甲氨基偶氮苯(DAB)免疫組織化學試劑盒購自北京康為生物世紀公司。SIRT3兔源單克隆抗體、葡萄糖轉運體1(Glut1)鼠源多克隆抗體、葡萄糖轉運體4(Glut4)鼠源多克隆抗體、乳酸脫氫酶(LDH)兔源單克隆抗體和丙酮酸脫氫酶(PDH)兔源單克隆抗體購自英國Abcam公司；β-actin鼠源單克隆抗體、單羧酸轉運蛋白4(MCT4)兔源多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、HRP標記的羊抗鼠二抗購自美國Santa Cruze Biotechnology公司。5810R型低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司、VE180型Western blot全套設備購自上海天能科技有限公司；PHILIPS EPIQ7C(S12-4探頭)超聲儀器購自荷蘭飛利浦公司；Nikon Eclipse E100 顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 動物實驗

16只2月齡SD大鼠體質量180～230 g，適應性飼養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為對照組和MCT組，每組8只，建模第1天MCT組大鼠腹腔注射1%MCT溶液(60 mg/kg)，對照組注射等體積生理鹽水。

1.3 超聲檢測

建模第28天，稱重，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，肢體連接電極記錄心電圖，大鼠胸部用脫毛膏脫毛，涂預熱超聲耦合劑，經胸超聲心動圖檢測右心功能的各項指標，包括肺動脈血流加速時間(PAAT)、三尖瓣收縮期位移(TAPSE)、右心室內徑(RVID)。

1.4 右心室收縮壓測定和右心室肥厚的檢測

采用右心導管法測量右心室收縮壓(RVSP)，引導器引導下從右頸總靜脈將PE50導管插入肺動脈，觀察BL-420S生物機能系統(tǒng)記錄界面的壓力波，波形穩(wěn)定1 min后記錄RVSP。記錄結束后分離肺組織和心臟組織，分別稱量右心室(RV)、左心室(LV)+室間隔(S)的質量，計算RV/(LV+S)的比值。

1.5 Western blot法檢測

取20 mg新鮮或冷凍肺組織，勻漿后4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清，測定蛋白含量。蛋白煮沸變性后，SDS-PAGE 電泳1.5 h，電轉2 h，封閉2 h。分別按照1∶400、1∶500、1∶200、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000的濃度加入Glut1、Glut4、MCT4、PDH、LDH、SIRT3、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。按照說明書的比例室溫孵育二抗45 min。采用Western blot熒光檢測試劑盒顯影，AlphaImager 2200圖像處理系統(tǒng)進行圖片灰度掃描并分析目的蛋白條帶的相對灰度值。

1.6 免疫組織化學染色

大鼠肺組織石蠟包埋，5 μm組織切片，采用生物素-鏈霉親和素-HRP法進行免疫組織化學染色，Glut1、Glut4、MCT4、PDH、LDH、SIRT3單克隆抗體濃度分別為1∶100、1∶100、1∶100、1∶200、1∶200、1∶200，陰性對照使用非特異血清代替一抗，顯微鏡下觀察染色結果，細胞漿呈棕黃色者為陽性細胞。

1.7 肺動脈重構的病理檢測

大鼠肺組織石蠟包埋，5 μm組織切片，蘇木素伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察肺血管病理改變，應用Leica Q550CW圖像處理與分析系統(tǒng)測量肺動脈的相對中膜厚度(RMT)及相對中膜面積(RMA)。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均值±標準差表示。對數(shù)據(jù)進行Levene方差齊性檢驗，結果顯示數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，兩組數(shù)據(jù)的總體方差齊。兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 成功建立PAH模型大鼠

SD大鼠腹腔注射28 d后進行超聲檢測，與對照組相比，MCT組的PAAT明顯下降，RVID明顯增大，TAPSE明顯縮短(P均<0.05)，見圖1；右心導管法檢測顯示，MCT組RVSP較對照組明顯增加(P< 0.01)；對心室組織進行稱量，MCT組RV/(LV+S)較對照組明顯增加(P<0.01)。見表1。

注：PAAT為肺動脈血流加速時間；RVID為右心室內徑；TAPSE為三尖瓣收縮期位移；RV為右心室；RA為右心房；LV為左心室；LA為左心房

表1 各組大鼠超聲心動圖指標比較

2.2 大鼠肺動脈結構改變

HE染色結果顯示，MCT組大鼠肺小動脈管腔狹窄，血管周圍炎性細胞浸潤；與對照組相比，MCT組肺小動脈血管壁明顯增厚[(378.47±129.97) μm對(105.16±61.17) μm,P<0.05]，見圖2。

注：A為對照組；B為MCT組

2.3 肺組織中Warburg效應關鍵酶和SIRT3的表達

Western blot法檢測肺組織中Warburg效應關鍵酶和SIRT3的表達情況，結果顯示，MCT組大鼠肺組織中Glut1、Glut4、LDH、MCT4蛋白表達水平較對照組明顯升高，PDH和 SIRT3蛋白表達水平較對照組明顯降低(P均<0.05)，見圖3、表3。

圖 3 各組大鼠肺組織Warburg效應關鍵酶和SIRT3蛋白表達水平

表3 各組大鼠肺組織Warburg效應關鍵酶和SIRT3蛋白表達水平比較

2.4 肺動脈血管中Warburg效應關鍵酶和SIRT3的表達

免疫組織化學染色法檢測肺血管中Warburg效應關鍵酶，與對照組相比，MCT組大鼠肺小動脈中膜Glut1、Glut4、LDH、MCT4的蛋白表達水平明顯升高，PDH和SIRT3的蛋白表達水平明顯降低(P均<0.05)，見圖4、表4。

3 討論

Warburg效應又稱有氧糖酵解，1956年，Warburg發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞在有氧條件下糖酵解途徑明顯增強，伴隨葡萄糖攝取增加，乳酸生成增加，該現(xiàn)象此后被稱為Warburg效應[5]。研究發(fā)現(xiàn)，PAH動物模型和患者中存在與Warburg效應相關的線粒體代謝方式改變[6]，為進一步明確PAH時血管局部是否存在Warburg效應，本研究采用Western blot和免疫組織化學染色法分別檢測了MCT-PAH大鼠肺組織和肺小動脈，結果顯示MCT-PAH大鼠肺組織和肺小動脈Warburg效應關鍵酶Glut1、Glut4、LDH、MCT4表達上調，且以上表達變化主要位于MCT-PAH大鼠肺小動脈中膜，表明肺動脈局部存在Warburg效應。

SIRT3是沉默信息調節(jié)因子(SIRT)蛋白家族成員，是主要的線粒體去乙?；竅7]，其表達或功能失調在惡性腫瘤[8]、PAH[9]、心室重構[10]等的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。SIRT3 通過去乙?；{節(jié)線粒體中多種糖代謝酶的活性，發(fā)揮調節(jié)葡萄糖代謝的作用[4]，主要方式為去乙酰化激活乙酰輔酶A 合成酶2[11]、丙酮酸脫氫酶磷酸酶[12]、異檸檬酸脫氫酶[13]、琥珀酸脫氫酶[14]，從而促使葡萄糖通過氧化磷酸化途徑代謝。Paulin等[9]證實MCT-PAH大鼠肺動脈線粒體SIRT3 表達下降，并伴隨線粒體蛋白乙?；潭仍龈?，通過基因治療上調SIRT3 表達可逆轉PAH[9]。本研究中Western blot結果顯示MCT-PAH大鼠肺組織中SIRT3表達下調，與Paulin等[9]的研究結果一致，免疫組織化學染色顯示肺小動脈中膜SIRT3表達下調明顯，提示SIRT3表達下調可能通過調節(jié)糖代謝通路在PAH發(fā)病中起重要作用。

圖 4 各組大鼠肺小動脈Warburg效應關鍵酶和SIRT3免疫組織化學染色結果

表4 各組大鼠肺小動脈Warburg效應關鍵酶和SIRT3蛋白表達水平比較

Warburg 效應的關鍵調節(jié)酶之一是PDH，正常細胞在氧供充足時PDH活化，葡萄糖通過氧化磷酸化途徑代謝，維持細胞三磷酸腺苷(ATP)供應正常，缺氧條件下PDH活性受抑制，導致葡萄糖氧化磷酸化途徑受抑，進而通過糖酵解途徑代謝，導致ATP 產量下降[12]。本研究證實，MCT-PAH大鼠模型肺小動脈中膜PDH 表達下降，并伴隨Warburg 效應關鍵酶表達升高，提示肺小動脈局部存在Warburg效應，PDH表達下調可能為其觸發(fā)原因之一。PDH與丙酮酸脫氫酶磷酸酶1(PDP1)、PDK1組成丙酮酸脫氫酶復合體并受二者雙重調節(jié)，PDP1催化PDH去磷酸化活化、PDK1催化PDH磷酸化失活。近期研究顯示，PDH不僅受磷酸化調節(jié)，同時還受乙酰化調節(jié)，PDH乙酰化時活性亦受到抑制。Fan等[12]研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞PDH、PDP1乙酰化程度升高，并伴隨Warburg 效應，通過基因干預抑制PDH、PDP1乙?；赡孓DWarburg 效應并抑制惡性腫瘤生長。Ozden等[15]發(fā)現(xiàn)乙?；潭壬邔е翽DH失活，SIRT3可直接通過催化惡性腫瘤細胞PDH去乙?；黾悠浠钚裕恍募〖毎鸖IRT3功能被抑制或表達下調時，PDH復合體乙酰化程度升高，PDH 失活，進而導致線粒體氧化磷酸化受抑[16]。以上研究表明，SIRT3 表達下調或功能被抑制時，不僅通過乙?；种芇DP1，導致PDH磷酸化失活，而且可直接催化PDH乙?；?，抑制其功能，從而促使葡萄糖代謝向Warburg 效應轉化。本研究結果證實，MCT-PAH肺小動脈局部SIRT3表達下調，推測其表達下調可能導致PDH乙酰化失活，從而進一步增強Warburg效應，因此SIRT3的表達下調引發(fā)的PDH活性下降可能也是MCT-PAH大鼠Warburg效應的始動因素之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MCT可誘導大鼠PAH形成，MCT-PAH大鼠肺組織存在Warburg效應關鍵酶表達上調和SIRT3表達下調，該研究為探討Warburg效應在PAH中的作用及可能的觸發(fā)機制提供了實驗基礎。