目前，心血管疾病是全球人類頭號死因，占死因構成的46%，且呈年輕化和持續(xù)增長的趨勢[1- 2]。糖尿病發(fā)病率升高是造成心血管疾病發(fā)病率居高不下的一個重要原因。既往研究表明，糖尿病患者并發(fā)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的風險是非糖尿病患者的4倍[3]。糖尿病患者血糖水平升高，其體內糖基化終末產物(AGEs)水平也明顯上升；AGEs可與糖基化終末產物受體(RAGE)結合，通過下游信號引起氧化應激和內皮功能紊亂，參與動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并動脈粥樣硬化患者的外周血中卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)顯著升高[5]。本研究旨在探討AGEs和FSTL1參與調控糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

通過臨床采血收集糖尿病合并動脈粥樣硬化患者血清；野生型C57BL/6小鼠(雄性，6周齡)購自南京大學模式動物研究中心[動物生產許可證號為SCXK(蘇)2015-0001，動物使用許可證號為SYXK(滬)2013-0050]，同種系RAGE基因敲除(RAGE-/-)小鼠由美國哥倫比亞大學贈送；檢測FSTL1和AGEs水平的ELISA試劑盒分別購自英國Abcam公司和中國武漢華美生物工程有限公司；小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自中國科學院細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)液及雙抗購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；AGEs-BSA購自德國Merck公司；兔抗人FSTL1單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗人RAGE、AP-1、c-Jun和β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶耦聯(lián)的羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling公司；正常小鼠IgG單克隆抗體購自美國eBioscience公司。

1.2 患者血清樣本收集

入組標準：經上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，收集糖尿病合并動脈粥樣硬化患者外周血。所有患者均簽署知情同意書。動脈粥樣硬化患者行冠狀動脈造影(CAG)和血管內超聲(IVUS)檢查確診，糖尿病患者行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)確診。共收集糖尿病合并動脈粥樣硬化患者血清104份，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測患者血清中FSTL1及AGEs水平。

排除標準：(1)有急性感染史；(2)有風濕性疾病史；(3)女性有近期月經史；(4)嚴重肝腎功能異常者。

1.3 小鼠腹腔巨噬細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

對野生型和同種系RAGE-/-小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 mL；靜置5～7 min后，用注射器抽取腹腔液；1 500 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌2次。用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液調節(jié)細胞密度至2×106個/mL，接種于培養(yǎng)瓶及6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)[6]。

將細胞懸液與0.4%錐蟲藍溶液按體積比為9∶1混合，混勻后在3 min內分別計數(shù)活細胞和死細胞。光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，死細胞被染為明顯的藍色，而活細胞呈無色透明狀。

1.4 RAGE抗體預處理

將小鼠RAW264.7巨噬細胞以2×106個/孔的密度接種至6孔板，用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入RAGE抗體(10 μg /mL)及正常小鼠IgG抗體(10 μg/mL，作為陰性對照)預處理1 h，然后加入不同質量濃度(0、50、100、200 μg/mL)的AGEs-BSA刺激24 h和48 h。

1.5 ELISA法檢測FSTL1及AGEs水平

將血液標本及不同濃度標準品分別加入96孔板中，于37 ℃孵育90 min。棄孔內液體后，倒扣96孔板并拍干孔內液體，加入生物素化抗體，用封板膠紙封住反應孔，于37 ℃孵育60 min。洗板拍干，加入親和素-生物素-辣根過氧化物酶復合物工作液，封孔，于37 ℃孵育30 min。洗板后拍干，加入顯色劑3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(90 μL/孔)，封孔，避光。于37 ℃孵育20 min。加入終止液100 μL/孔，混勻后即刻測量450 nm處吸光度。

1.6 Western blot法檢測相關蛋白表達

用RIPA裂解液提取不同條件培養(yǎng)后的小鼠RAW264.7巨噬細胞和小鼠腹腔原代巨噬細胞中的總蛋白，同時收集細胞培養(yǎng)液上清液。取20 μg總蛋白，經緩沖液處理后加熱變性，以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(100 V穩(wěn)壓)分離蛋白；然后采用電轉移法，將蛋白條帶轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉1 h；漂洗后分別加入兔抗人FSTL1、RAGE、AP-1、c-Jun和β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；Tris-HCl緩沖液(TBST)漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h；TBST漂洗后，成像儀曝光并分析目的蛋白條帶的相對灰度值。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。各計量資料進行正態(tài)性檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用對數(shù)轉換后符合正態(tài)分布，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。兩組連續(xù)性變量比較采用Pearson相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病合并動脈粥樣硬化患者外周血FSTL1與AGEs水平呈正相關

運用ELISA法分別檢測104例糖尿病合并動脈粥樣硬化患者外周血中FSTL1及AGEs水平，并對兩者進行相關性分析。結果發(fā)現(xiàn)，在糖尿病合并動脈粥樣硬化患者中，血清AGEs水平與FSTL1水平呈正相關(r=0.148，P=0.021)，見圖1。

圖1 糖尿病合并動脈粥樣硬化患者外周血中AGEs與FSTL1水平的相關性分析

2.2 AGEs通過AGEs-RAGE信號通路促進巨噬細胞中FSTL1的表達和分泌

為驗證AGEs與FSTL1表達及分泌量之間的關系，用不同質量濃度的AGEs-BSA(0、50、100、200 μg/mL)刺激小鼠RAW264.7細胞24 h。Western blot法檢測結果顯示，巨噬細胞中FSTL1的表達及分泌量明顯增加，且在AGEs-BSA質量濃度為200 μg/mL時FSTL1表達及分泌量最高(P均<0.05)，見圖2A。

為明確AGEs是否通過AGEs-RAGE信號通路調控FSTL1的表達及分泌，進一步運用RAGE特異性抗體阻斷RAW 264.7細胞中AGEs-RAGE信號通路。Western blot檢測結果顯示，與陰性對照組相比，RAGE特異性抗體顯著抑制AGEs-BSA誘導的FSTL1表達及分泌(P均<0.05)，見圖2B。

注：A為不同濃度的AGEs-BSA刺激巨噬細胞24 h后，Western blot法檢測FSTL1的表達及分泌量；B為使用RAGE抗體(10 μg/mL )拮抗AGEs-RAGE信號通路，并且使用AGEs-BSA(200 μg/mL)刺激巨噬細胞24 h后，Western blot法檢測FSTL1的表達及分泌量

2.3 AGEs通過AGEs-RAGE信號通路促進巨噬細胞中核轉錄因子AP-1和c-Jun的表達

用不同質量濃度的AGEs-BSA(0、50、100、200 μg/mL)分別刺激RAW264.7細胞24 h及48 h，運用Western blot法檢測AP-1和c-Jun的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，AGEs-BSA刺激細胞24 h和48 h后，細胞AP-1和c-Jun的表達水平明顯升高(P均<0.05)，見圖3A。分離培養(yǎng)野生型及RAGE-/-小鼠原代巨噬細胞，并分別予以AGEs-BSA(200 μg/mL)刺激，Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，RAGE-/-組AP-1和c-Jun的表達水平明顯下降(P均<0.05)，見圖3B、C。同樣，用AGEs-BSA(200 μg/mL)刺激RAW264.7細胞，并運用RAGE特異性抗體阻斷AGEs-RAGE信號通路，Western blot法檢測結果顯示，RAGE特異性抗體顯著抑制AP-1和c-Jun的表達(P均<0.05)，見圖3D。

注：A為不同質量濃度AGEs-BSA刺激RAW 264.7細胞后，Western blot法檢測AP-1及c-Jun的表達；B為RAGE-/-小鼠的表型鑒定；C為200 μg/mL AGEs-BSA分別刺激野生型小鼠及RAGE-/-小鼠來源的原代巨噬細胞后，Western blot法檢測AP-1及c-Jun的表達；D為200 μg/mL AGEs-BSA刺激RAW264.7細胞后，用RAGE特異性抗體阻斷AGEs-RAGE信號通路，Western blot法檢測AP-1及c-Jun的表達

3 討論

糖尿病是一種普遍存在且嚴重損害人類健康的疾病，它不單純是一種糖類物質代謝障礙性疾病，目前被認為是冠心病的等危癥。糖尿病患者因心肌梗死導致死亡的風險是非糖尿病患者的2～3倍[7]。糖尿病患者體內持續(xù)的高血糖環(huán)境可以促進糖代謝產物與蛋白質、脂質或核酸的還原性氨基發(fā)生非酶促糖基化反應，最終形成AGEs。AGEs可與特異性受體RAGE、半乳糖凝集素-3(Gal-3)及巨噬細胞清道夫受體等結合而發(fā)揮作用[8]。已有研究證實，在糖尿病合并動脈粥樣硬化患者的斑塊組織中RAGE呈高表達，且由其介導的損傷在糖尿病心血管系統(tǒng)損傷中占主導地位[9]。

FSTL1是一種由間充質細胞產生的糖化分泌蛋白，屬于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)家族[10]。FSTL1參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，可能與炎性反應、血管新生、細胞增殖和凋亡、腫瘤細胞遷移和侵襲、突觸傳遞有關[11-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL1高表達于糖尿病動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細胞中，而且FSTL1可顯著促進巨噬細胞中白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和β-干擾素(IFN-β)等炎性因子的表達[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動脈粥樣硬化患者外周血AGEs水平與FSTL1水平呈正相關。因此，推測FSTL1高表達于糖尿病動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細胞，可能與外周血中高濃度的AGEs有關。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，用AGEs刺激巨噬細胞后，F(xiàn)STL1表達及分泌量均上升。既往研究表明，糖尿病合并動脈粥樣硬化患者的斑塊組織中RAGE呈高表達。因此，本研究進一步運用RAGE特異性抗體阻斷AGEs-RAGE信號通路，觀察FSTL1的表達情況，發(fā)現(xiàn)RAGE抗體封閉其受體活性后，F(xiàn)STL1的表達及分泌量均被明顯抑制，提示AGEs-RAGE信號通路可能參與調控糖尿病動脈粥樣硬化中FSTL1的表達。

AGEs-RAGE信號通路主要通過激活核因子κb(NF-κb)及AP-1，促進炎性因子的表達[14-15]。為進一步明確RAGE信號通路對FSTL1表達的調控作用，本研究根據(jù)前期對FSTL1基因結構的分析結果，推測FSTL1基因5′啟動子區(qū)受轉錄因子AP-1和c-Jun的調節(jié)。本研究進一步用AGEs-BSA刺激巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)AP-1及c-Jun表達水平升高；分別采用RAGE特異性抗體及構建RAGE-/-小鼠以阻斷AGEs-RAGE信號通路，結果發(fā)現(xiàn)巨噬細胞中AP-1和c-Jun的表達水平均明顯降低。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AGEs-RAGE信號通路通過調控巨噬細胞中轉錄因子AP-1及c-Jun的表達來調節(jié)FSTL1活性，而且FSTL1是一個潛在的影響糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的調控因子。本研究揭示了AGEs和FSTL1在糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用機制，這為尋找糖尿病動脈粥樣硬化藥物防治的新靶點提供了線索。但對于AGEs調控FSTL1表達的具體分子機制，還有待于更深入的研究。