王艷麗，孟雅靜，何宏魁，張會(huì)敏，劉國英，王錄，劉露，李靜心

(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州，236800)

濃香型白酒的釀造過程是環(huán)境微生物、大曲微生物和窖泥微生物等復(fù)雜物質(zhì)能量代謝的過程[1]。通過發(fā)酵過程中產(chǎn)生的黃水的介導(dǎo)，窖泥與酒醅之間不斷進(jìn)行微生物和物質(zhì)能量的交換，既為酒醅的發(fā)酵提供了豐富的微生物種群，又實(shí)現(xiàn)了窖泥自身的新陳代謝[2]。窖泥微生物經(jīng)過長期的馴化和發(fā)展，慢慢形成了自身獨(dú)特的微生物群落，其中主要的有益功能菌，有大量的是厭氧菌微生物，他們種類、數(shù)量繁多且復(fù)雜[3-5]。正是這些有益功能菌的大量生長、繁殖以及相互協(xié)調(diào)作用，才賦予了白酒獨(dú)特的香型，造就了以己酸乙酯為主體香的濃香型白酒典型風(fēng)格[6]。因此，濃香型白酒的品質(zhì)與窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣關(guān)系密切。

濃香型窖池中的窖泥是由特定的泥料在人工發(fā)酵培養(yǎng)后形成的，窖池泥經(jīng)過長期、連續(xù)的生產(chǎn)，不斷被馴化并慢慢趨于老熟，并最終形成對(duì)酒質(zhì)的提高及穩(wěn)定至關(guān)重要的優(yōu)質(zhì)老窖泥，正所謂“千年老窖，萬年糟”和“酒好全憑窖池老”[7]。但是窖池經(jīng)過幾年的生產(chǎn)發(fā)酵，窖泥中原有的營養(yǎng)物質(zhì)被微生物不斷吸收和利用而逐漸減少，有害物質(zhì)則不斷積累，再加上養(yǎng)護(hù)措施不合理，于此同時(shí)，由其他多種因素導(dǎo)致的窖泥中以己酸菌為主體的有益功能菌的生長、繁殖受到限制，以及菌種的退化等原因，導(dǎo)致窖泥出現(xiàn)不同的退化、老化。最明顯表現(xiàn)是窖壁泥起堿、變硬，窖池底部表面開始出現(xiàn)白色顆粒狀(以乳酸鈣為主)和針狀(以乳酸亞鐵為主)結(jié)晶，此時(shí)養(yǎng)護(hù)不及時(shí)，白色顆粒會(huì)逐漸發(fā)展為白色大塊團(tuán)狀結(jié)晶物質(zhì)，引起窖泥的老化板結(jié)。摘酒質(zhì)量明顯降級(jí)，表現(xiàn)為酒味雖純正、醇和，但窖香不明顯，主體風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯含量降低[8]。

本研究以退化窖池、正常新窖池和優(yōu)質(zhì)老窖為對(duì)象，深入分析其窖泥微生物、理化特性以及黃水與加漿水的理化特性方面的差異，旨在掲示各理化指標(biāo)對(duì)窖池退化的影響，為窖池養(yǎng)護(hù)與預(yù)防退化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要材料

窖泥樣品取自某酒廠退化窖泥、正常新窖泥和優(yōu)質(zhì)老窖泥[9]，每類樣品各取3份(每份約400 g)，這3份窖泥分別采自不同窖池的3類窖泥樣品。退化窖池和正常新窖池均為有5年窖齡的人工老窖窖池，優(yōu)質(zhì)老窖為30年窖齡的老窖池。

1.1.2 主要試劑

TIAGE土壤DNA提取試劑盒，質(zhì)粒DNA提取試劑盒(生工生物工程有限公司)，TAKARATaq，TAKARA SYBR Fast QPCR Mix。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TU-1901/UV-9000紫外-可見光分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Piko Real熒光定量PCR儀，美國賽默飛世爾科技公司；G-26C高速冷凍離心機(jī)，德國賽多利斯；MN-913超微量核酸檢測儀，美國MaestroGen公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥取樣方法

窖池窖底中心和4個(gè)角各取一點(diǎn)，在無菌袋中混勻后分成2份，分別置于4 ℃冰箱(測窖泥理化指標(biāo))和-80 ℃冰箱(窖泥DNA提取)。

1.2.2 窖泥處理

窖泥取回后，置于室內(nèi)自然風(fēng)干，磨成粉末后，60目過篩，保存、備用。

1.2.3 窖泥微生物定量方法

取0.25 g新鮮窖泥樣品，進(jìn)行DNA提取后加入70 μL無菌水洗脫，取1 μL DNA模板，采用341F5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’和517R 5’-TTACCGCGGCTGCTGGC-3’為引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因V3可變區(qū)，擴(kuò)增片段約177 bp左右，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每個(gè)窖泥樣品細(xì)菌的拷貝數(shù)，具體方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.4 窖泥理化分析方法

水分測定：烘干法[11]；pH值：電位法[12]；腐殖質(zhì)：重鉻酸鉀氧化法[13]；銨態(tài)氮：紫外-可見光分光光度法測定[13]；有效磷含量：氟化氨-鹽酸提取法[14]；有效鉀[15]、窖泥鐵測定：紫外-可見光分光光度法[16]；窖泥鈣、鎂測定：EDTA滴定法。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.5、SAS 9.0、SPSS 22和R語言軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同質(zhì)量等級(jí)窖泥理化因子的差異

2.1.1 不同質(zhì)量等級(jí)窖泥樣品的水分含量和pH值的差異

水分和pH值在濃香型白酒釀造過程中起著重要的作用，水分含量過高會(huì)導(dǎo)致窖泥掛壁難甚至垮窖，水分缺失又會(huì)導(dǎo)致窖泥板結(jié)，鹽類析出，窖泥中部分微生物死亡最終導(dǎo)致窖泥老化[17]，窖泥中微生物的生長繁殖和代謝受窖池酸度的影響較大，嚴(yán)重影響生產(chǎn)，因此對(duì)窖泥中水分和pH值的監(jiān)測至關(guān)重要。

本試驗(yàn)研究了不同質(zhì)量等級(jí)窖泥間水分含量和pH值的差異，如圖1所示。優(yōu)質(zhì)窖泥、正常新窖泥和退化窖泥不同質(zhì)量等級(jí)間水分含量差異顯著(P<0.05)，其中優(yōu)質(zhì)窖泥水分含量顯著高于正常新窖泥(P<0.05)，正常新窖泥水分含量顯著高于退化窖泥(P<0.05)。而優(yōu)質(zhì)窖泥、正常新窖泥和退化窖泥不同質(zhì)量等級(jí)間pH值差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同質(zhì)量等級(jí)窖池窖泥水分含量和pH值的差異
Fig.1 Difference of water content and pH value of pits
with different quality grades
注：水分含量和pH值含量差異顯著性分別用大寫和小寫英文
字母來表示，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 不同質(zhì)量等級(jí)窖泥樣品的銨態(tài)氮和腐殖質(zhì)含量的差異

銨態(tài)氮是有機(jī)質(zhì)經(jīng)微生物分解而形成的，以鹽的形式存在，可以被窖泥微生物直接利用，其含量高低在一定程度上體現(xiàn)了窖泥對(duì)微生物生長代謝所需氮元素的供給能力[18]。腐殖酸是窖泥中重要的有機(jī)質(zhì)[19]，腐殖質(zhì)的重要組成部分，是由微生物代謝物日積月累而形成，在土壤學(xué)中，其含量能夠反應(yīng)窖泥肥力。有研究表明[20]，腐殖酸是窖泥成熟的重要標(biāo)志，其含量隨著窖齡的增加而升高。

本試驗(yàn)研究了不同質(zhì)量等級(jí)窖泥間銨態(tài)氮和腐殖質(zhì)含量的差異。如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量等級(jí)窖池窖泥銨態(tài)氮和腐殖質(zhì)含量的
差異
Fig.2 Differences in the content of ammonium nitrogen and
humus in pits of pits with different quality grades
注：銨態(tài)氮和腐殖質(zhì)含量差異顯著性分別用大寫和小寫英文
字母來表示，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

銨態(tài)氮含量優(yōu)質(zhì)窖泥、正常新窖泥和退化窖泥之間差異顯著，其中優(yōu)質(zhì)窖泥顯著高于正常新窖泥(P<0.05)，正常新窖泥又顯著高于退化窖泥(P<0.05)。

優(yōu)質(zhì)窖泥的腐殖質(zhì)含量顯著高于正常新窖泥和退化窖泥(P<0.05)，但正常新窖泥和退化窖泥間腐殖質(zhì)含量差異不顯著(P>0.05)。

2.1.3 不同質(zhì)量等級(jí)窖泥樣品的有效磷和有效鉀含量的差異

有效磷是水溶性的和有機(jī)態(tài)的易被微生物直接吸收利用的磷，是微生物生長代謝必不可少的元素。研究表明有效磷含量與土壤中微生物生物量及代謝呈正相關(guān)關(guān)系[21]。

本試驗(yàn)研究了不同質(zhì)量等級(jí)窖泥間有效磷和有效鉀含量的差異，如圖3所示。優(yōu)質(zhì)窖泥有效磷和有效鉀含量的都顯著高于正常新窖泥和退化窖泥(P<0.05)，正常新窖泥與退化窖泥之間有效磷和有效鉀含量差異都不顯著(P>0.05)。

圖3 不同質(zhì)量窖池窖泥有效磷和有效鉀含量的差異
Fig.3 Differences of effective phosphorus and effective
potassium content in pits with different quality grades
注：有效磷和有效鉀含量差異顯著性分別用大寫和小寫英文
字母來表示，有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，無相同
字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.4 不同質(zhì)量等級(jí)窖泥樣品的鈣和鎂含量的差異

微生物的生長、繁殖離不開各種礦物質(zhì)元素，并與各種礦物質(zhì)元素之間存在著多種循環(huán)代謝和信息傳遞的關(guān)系，這些礦物質(zhì)元素也是窖泥微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。但是當(dāng)窖泥中鈣、鎂等礦物質(zhì)元素含量過高、水分缺失時(shí)就會(huì)與窖池中的酸類作用形成晶體析出，造成窖泥退化、酒質(zhì)和產(chǎn)量降低的現(xiàn)象，對(duì)整個(gè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響，因此對(duì)窖泥中的鈣、鎂含量進(jìn)行監(jiān)測具有重要作用。

本試驗(yàn)研究了不同質(zhì)量等級(jí)窖泥間鈣和鎂含量的差異，如圖4所示。退化窖泥鈣含量顯著高于優(yōu)質(zhì)窖泥和正常新窖泥(P<0.05)，正常新窖泥鈣含量又顯著高于優(yōu)質(zhì)窖泥(P<0.05)。而鎂含量在退化窖泥、正常新窖泥和優(yōu)質(zhì)窖泥不同質(zhì)量等級(jí)之間差異都不顯著(P>0.05)。

圖4 不同質(zhì)量等級(jí)窖池窖泥鈣和鎂含量的差異
Fig.4 Differences of calcium and magnesium content in pits
with different quality grades
注：鈣和鎂含量差異顯著性分別用大寫和小寫英文字母來表示，
有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，無相同字母表示差異
顯著(P<0.05)。

2.1.5 不同質(zhì)量等級(jí)窖泥樣品的鐵含量的差異

鐵是土壤中的微量元素，它主要是給微生物提供微量營養(yǎng)成分，以及參與多種生化反應(yīng)(或作為催化劑)，鐵在土壤中主要來源有：氧化物、硫化物和它們的水解離子，而它對(duì)土壤及生物的作用并不是它的總量，而是它的有效態(tài)含量和由轉(zhuǎn)化條件決定。在釀酒生產(chǎn)中，常有窖泥老化現(xiàn)象：窖泥表面鹽堿化，板結(jié)而堅(jiān)硬，含水量少，透水性能逐步降低，并由表及里發(fā)展。老化窖泥與優(yōu)質(zhì)老窖的土壤成分最大差異在于窖泥中鐵元素的存在形態(tài)。鐵在窖泥不同氧化還原電位下，呈現(xiàn)不同的形態(tài)。當(dāng)窖泥處于中度還原電位時(shí)，受糟醅淋漿、pH等因素的影響，活性鐵大量積累，主要以乳酸亞鐵為主。乳酸亞鐵的積累和結(jié)晶，對(duì)窖泥微生物產(chǎn)生毒害作用，使窖泥失去產(chǎn)香功能，進(jìn)而老化[22]。

本試驗(yàn)研究了不同質(zhì)量等級(jí)窖泥間鐵含量的差異。如圖5所示：退化窖泥、正常新窖泥、優(yōu)質(zhì)窖泥3者之間的鐵含量均呈顯著性差異(P<0.05)，且退化窖泥的鐵含量顯著高于正常新窖泥(P<0.05)，正常新窖泥的鐵含量顯著高于優(yōu)質(zhì)窖泥(P<0.05)。

圖5 不同質(zhì)量等級(jí)窖池窖泥鐵含量的差異
Fig.5 Differences of iron content in pits with different
quality grades
注：鐵含量差異顯著性用大寫英文字母來表示，有相同字母
表示差異不顯著(P>0.05)，無相同字母表示差異顯著
(P<0.05)。

2.1.6 窖泥理化指標(biāo)主成分分析

對(duì)退化窖泥(C1、C2、C3)、新窖泥(B1、B2、B3)和優(yōu)質(zhì)老窖泥(A1、A2、A3)中水分、銨態(tài)氮、腐殖質(zhì)、有效鉀、有效磷、pH值、鎂、鐵和鈣進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖6所示，PCA分析結(jié)果表明窖泥理化因子與窖泥質(zhì)量呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。不同質(zhì)量的窖泥能很好的聚成3類，即優(yōu)質(zhì)窖泥、新窖泥及退化窖泥。這也表明,利用窖泥理化指標(biāo)判定和預(yù)測窖泥的質(zhì)量是可行的。

圖6 主成分分析結(jié)果
Fig.6 Result of principal component analysis (PCA)

2.2 窖泥理化指標(biāo)和細(xì)菌總量參數(shù)比較分析

如表1所示，退化、正常新窖及優(yōu)質(zhì)窖泥樣品中水分、銨態(tài)氮、鈣和鐵含量均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)。其中退化窖泥中的鈣和鐵含量分別是正常及優(yōu)質(zhì)窖泥中的1.90～6.65和6.56～24.95倍，而其他理化指標(biāo)均低于正常及優(yōu)質(zhì)窖泥中相應(yīng)理化指標(biāo)。

表1 退化、新窖泥及優(yōu)質(zhì)窖泥中理化指標(biāo)和細(xì)菌總量參數(shù)比較分析表(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3)Table 1 Biogeochemical attributes (means±standard deviation, n=4) in degraded, normal and high-quality FPMs

注：每行不同字母(a、b和c)表示不同質(zhì)量窖泥理化指標(biāo)和細(xì)菌總量的差異性(P<0.05)。

退化與正常窖泥相比，pH、腐殖質(zhì)、有效磷、有效鉀、鎂和細(xì)菌總量均無明顯差異(P>0.05)。正常與優(yōu)質(zhì)窖泥相比，除鎂含量指標(biāo)外其他指標(biāo)均存在明顯差異(P<0.05)。

2.3 窖泥理化數(shù)值和細(xì)菌總量相關(guān)性研究

任何環(huán)境或發(fā)酵體系中的微生物都受制于其周圍理化因子的影響，這也是微生物在窖泥中不斷被馴化、富集及淘汰的理論基礎(chǔ)[9]。因此，研究窖池環(huán)境因子與微生物總量的相關(guān)性有助于分析窖池退化因子，并制定相應(yīng)的策略去養(yǎng)護(hù)窖泥中的微生物。關(guān)于窖泥中理化因子許多白酒廠都進(jìn)行了相關(guān)研究[23-25]。本研究嘗試從窖泥內(nèi)部理化因子之間的關(guān)系變化以及與細(xì)菌總量之間的相關(guān)性來分析窖泥退化的可能原因。本研究使用統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性系數(shù)公式計(jì)算窖泥理化因子、細(xì)菌總量之間的相關(guān)性系數(shù)，相關(guān)系數(shù)在-1～1，負(fù)數(shù)表示負(fù)相關(guān)，正數(shù)表示正相關(guān)，絕對(duì)值越大相關(guān)性越強(qiáng)[26]。結(jié)果如圖7所示，窖泥細(xì)菌總量與銨態(tài)氮、有效磷、腐殖質(zhì)、水分、有效鉀和pH的相關(guān)系數(shù)呈正相關(guān)，其中銨態(tài)氮、有效磷和有效鉀正相關(guān)影響強(qiáng)度最大，說明營養(yǎng)物質(zhì)是微生物賴以生存的基礎(chǔ)，在任何環(huán)境下影響都最大，而水分和pH值對(duì)環(huán)境微生物生長影響也較大，是微生物生命活動(dòng)的基本條件之一，所選環(huán)境因子對(duì)窖泥細(xì)菌總量正相關(guān)影響，依次為銨態(tài)氮、有效磷、有效鉀、水分、腐殖質(zhì)和pH值。而窖泥細(xì)菌總量與鎂、鈣和鐵含量呈明顯負(fù)相關(guān)，特別是鈣和鐵與窖泥細(xì)菌負(fù)相關(guān)性很強(qiáng)，這也說明鈣和鐵作為窖池退化的指標(biāo)，是由于其含量的增加嚴(yán)重影響了窖泥微生物的生長，從而引起的窖池窖泥結(jié)晶甚至板結(jié)退化，鎂含量對(duì)窖泥細(xì)菌總量也存在一定的負(fù)相關(guān)，說明鎂含量的增加不利于窖泥微生物的生長。因此在窖池養(yǎng)護(hù)過程中要注意監(jiān)控窖泥鎂、鈣和鐵含量的變化。

圖7 窖泥理化與細(xì)菌總量相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果
Fig.7 Correlation analysis results of the total amount of
bacteria and biogeochemical properties in the pits

3 結(jié)論

(1)對(duì)不同質(zhì)量等級(jí)窖泥的理化指標(biāo)進(jìn)行差異性比較分析，發(fā)現(xiàn)各等級(jí)間水分、銨態(tài)氮、鈣和鐵含量均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，特別是退化窖泥中的鈣和鐵含量顯著高于正常及優(yōu)質(zhì)窖泥，而水分和銨態(tài)氮含量均低于正常及優(yōu)質(zhì)窖泥，因此可以推測窖泥退化是由于窖泥中的鈣、鐵含量大量積累，從而影響了窖泥中水分和銨態(tài)氮含量的降低。退化與正常窖泥相比，pH、腐殖質(zhì)、有效磷、有效鉀、鎂和細(xì)菌總量均無明顯差異(P>0.05)，說明這幾個(gè)理化指標(biāo)是間接性造成窖泥退化的因子。除鎂含量外，正常與優(yōu)質(zhì)窖泥相比其他各理化指標(biāo)均存在明顯差異(P<0.05)，說明窖泥理化因子與窖泥質(zhì)量呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，新窖在向老窖轉(zhuǎn)變的過程中窖泥各環(huán)境因子也在發(fā)生明顯變化。

(2)銨態(tài)氮和有效磷、腐殖質(zhì)、水分、有效鉀和pH對(duì)窖泥細(xì)菌總量呈正相關(guān)影響，而鎂、鈣和鐵含量對(duì)窖泥細(xì)菌總量呈明顯負(fù)相關(guān)影響，說明窖泥理化因子是影響窖泥微生物生長的主要因素，也是反映窖池退化的重要指標(biāo)，鎂、鈣和鐵在適量的情況下對(duì)窖泥微生物生長有益，過量與窖泥退化有直接的關(guān)系，同時(shí)也對(duì)窖泥微生物的生長造成不利的影響。