王旭輝，徐鑫，寶哲，王卉，葉凱，李冠*，鄧宇

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830046)2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物質(zhì)能源研究所，新疆 烏魯木齊，830091)3(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，新疆 烏魯木齊，830091)4(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站，北京，100125) 5(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所，四川 成都，610041)

我國(guó)具有豐富的生物質(zhì)資源，包括農(nóng)業(yè)、林業(yè)等產(chǎn)業(yè)的殘留物及其副產(chǎn)品，工業(yè)及市政中可生物降解的廢棄物等[1-2]。農(nóng)業(yè)廢棄物占整個(gè)生物質(zhì)能源的21%，其中主要有秸稈等纖維素生物質(zhì)，畜禽糞便以及水果蔬菜在貯存、運(yùn)輸、加工中產(chǎn)生的廢棄物[3-6]。這些生物質(zhì)資源富含有機(jī)物，可用于生產(chǎn)沼氣、還田施肥、飼料加工等[7-8]。然而這些資源并沒有得到有效利用，大部分的農(nóng)作物秸稈被直接燃燒、丟棄，造成嚴(yán)重的大氣污染和資源浪費(fèi)現(xiàn)象[9-10]。通過(guò)秸稈混合糞便的沼氣工程不但可以解決秸稈廢棄物的再利用問(wèn)題，避免了燒荒帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題和資源浪費(fèi)，還能調(diào)節(jié)能源結(jié)構(gòu)、減少化石能源的消耗，找到了解決清潔能源發(fā)展的新突破口，促進(jìn)了種、養(yǎng)殖業(yè)的協(xié)調(diào)發(fā)展和我國(guó)生物質(zhì)資源的循環(huán)利用，對(duì)實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[11-14]。

沼氣工程是畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便秸稈廢棄物污染治理的最主要解決辦法[15-17]。國(guó)內(nèi)外相繼開展了糞便與秸稈聯(lián)合發(fā)酵的研究，MICHAL[18]認(rèn)為玉米秸稈和糞便的協(xié)同作用可以提高厭氧發(fā)酵能力，增加沼氣產(chǎn)量。李軼冰[19]等研究了溫度對(duì)玉米秸稈和糞便混合發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)溫度與發(fā)酵速率和累積產(chǎn)氣量呈正相關(guān)。MARCIN[20]等研究了經(jīng)預(yù)處理后的秸稈與牛糞聯(lián)合發(fā)酵，相比于單牛糞原料發(fā)酵沼氣產(chǎn)率每天增加速率為177mL/mgVS。LUO[21]等研究了牛糞與玉米秸稈混合發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)混合原料產(chǎn)氣速率和產(chǎn)沼氣總量明顯的高于單一原料。周莎[22]等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雞糞與小麥秸稈的混合比例為1∶1時(shí)，甲烷的產(chǎn)氣量達(dá)到90.56mL/gVS。劉永[23]通過(guò)牛糞和水稻秸稈混合發(fā)酵的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛糞和水稻秸稈以1∶1混合時(shí)，最大產(chǎn)氣率可達(dá)到398mL/gVS。FENG[24]通過(guò)采用不同秸稈和雞糞混合進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵，玉米秸稈與雞糞以3∶1比例混合后，共消化產(chǎn)氣效果最好，通過(guò)高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，共消化過(guò)程中的主要微生物為廣古菌、擬桿菌和厚壁菌。這些研究結(jié)果表明，通過(guò)多種方法利用糞便與秸稈聯(lián)合發(fā)酵提高沼氣發(fā)酵效率是沼氣工程的重要發(fā)展方向。

沼氣工程獲得高效產(chǎn)出，除了固定的發(fā)酵原料，高效的沼氣微生物種群也是沼氣池穩(wěn)定高效運(yùn)行的關(guān)鍵[25-28]。沼氣發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，包括水解階段、產(chǎn)酸階段和產(chǎn)甲烷階段，在不同階段中微生物菌群結(jié)構(gòu)也不同，因此有必要采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)深入研究發(fā)酵過(guò)程中微生物的群落結(jié)構(gòu)[29-30]。高通量測(cè)序技術(shù)是目前應(yīng)用最普遍的新一代測(cè)序技術(shù)。它在分析微生物的群落結(jié)構(gòu)時(shí)有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠通過(guò)從環(huán)境樣本中直接獲取的總DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序[31]，用16SrRNA基因的測(cè)序數(shù)據(jù)估計(jì)微生物群落的物種構(gòu)成，能更加真實(shí)地揭示原位環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性[32-35]。SONG等[36]對(duì)沼氣發(fā)酵過(guò)程中高通量測(cè)序的結(jié)果表明，微生物群體從乙酰梭菌產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌和甲烷球菌?；魩浀萚37]對(duì)牛糞堆肥發(fā)酵過(guò)程添加益生菌劑，通過(guò)高通量測(cè)序表明變形菌門細(xì)菌顯著增加，說(shuō)明菌劑的添加可以顯著改變微生物種群群落。

本研究以玉米秸稈-牛糞沼氣發(fā)酵為對(duì)象，以沼氣產(chǎn)量為指標(biāo)篩選高效微生物菌劑，利用高通量分子技術(shù)對(duì)添加高效微生物菌劑的不同發(fā)酵階段牛糞沼液細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)菌群多樣性變化規(guī)律進(jìn)行分析，研究常溫條件下牛糞秸稈沼氣發(fā)酵細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)菌群多樣性變化規(guī)律，為新疆地區(qū)牛糞秸稈沼氣發(fā)酵菌劑的制備提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原材料與試劑

玉米秸稈來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所瑪納斯試驗(yàn)基地，風(fēng)干、粉碎至粒徑≤4 mm，通過(guò)堿液對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理。添加菌劑為實(shí)驗(yàn)室自制秸稈專用微生物菌劑[38]，菌劑含有蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌。菌劑1中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質(zhì)量比3∶2∶3∶2)，菌劑2中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質(zhì)量比4∶3∶3∶2)，菌劑3中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質(zhì)量比2∶1∶2∶1)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試驗(yàn)裝置

UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì),日本島津公司；安捷倫GC 6890N,美國(guó)安捷倫公司。本試驗(yàn)所用裝置主要由厭氧發(fā)酵裝置、集氣裝置及控溫裝置3 部分組成。發(fā)酵裝置采用500 mL的廣口瓶，用橡膠塞密封，再用玻璃管與乳膠管相連接，集氣裝置由乳膠管與集氣袋連接而成，恒溫水浴鍋控制廣口瓶中發(fā)酵料液溫度。

1.3 分析方法

水分測(cè)定采用105 ℃恒重法[39]；纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量采用范氏法測(cè)定[40-41]。沼氣中的CH4采用氣相色譜分析，設(shè)備配置為熱導(dǎo)檢測(cè)器，載氣為氮?dú)?，流量設(shè)為30 mL/mm，進(jìn)樣口、柱箱和檢測(cè)器溫度分別為120、100、120 ℃。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 不同秸稈預(yù)處理效果比較

(1)空白處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預(yù)處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入水浴鍋中，溫度為35 ℃，預(yù)處理48 h。

(2)對(duì)照處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預(yù)處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入超聲波儀中，超聲30 min，放入水浴鍋中，溫度為35 ℃，預(yù)處理48 h。

(3)堿液處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預(yù)處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入超聲波儀中，超聲30 min，加入5 g NaOH，放入水浴鍋進(jìn)行堿預(yù)處理，溫度為35 ℃，預(yù)處理48 h。

1.4.2 不同微生物菌劑的產(chǎn)氣效果比較

(1)空白處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發(fā)酵瓶中，加入預(yù)處理后的秸稈粉50 g，最后加去離子水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25℃恒溫培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7。在發(fā)酵的每天上午10點(diǎn)記錄沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量。

(2)微生物菌劑1處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發(fā)酵瓶中，加入預(yù)處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑1，最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7。在發(fā)酵的每天上午10點(diǎn)記錄沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量。

(3)微生物菌劑2處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發(fā)酵瓶中，加入預(yù)處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑2，最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7。在發(fā)酵的每天上午10點(diǎn)記錄沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量。

(4)微生物菌劑3處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發(fā)酵瓶中，加入預(yù)處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑3。最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7。在發(fā)酵的每天上午10點(diǎn)記錄沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量。

1.4.3 微生物總DNA的提取與純化

選擇產(chǎn)氣效果最好的處理組進(jìn)行不同發(fā)酵時(shí)期的高通量微生物測(cè)序。提取發(fā)酵0天，15天，30天樣品，使用糞便基因組提取試劑盒(天根DP328，中國(guó))完成沼液樣品中細(xì)菌DNA 的提取。所有樣品的細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)域擴(kuò)增用引物338F (5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。所有樣品的真菌ITS1區(qū)擴(kuò)增用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和引物ITS2R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。

使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒完成(天根DP209，中國(guó))PCR產(chǎn)物純化，然后分別使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳判斷純化產(chǎn)物的濃度與純度。文庫(kù)的制備和上機(jī)測(cè)序委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.4.4 序列分析

基于Miseq Illumina平臺(tái)的測(cè)序得到不同發(fā)酵時(shí)期沼液樣品文庫(kù)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列。使用QIIME[42]軟件中的UCLUST[43]對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU，并基于Silva(細(xì)菌)和UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，用Mothur曲線可以分析所有樣品中細(xì)菌豐度[44]。Alpha多樣性可以用于分析單個(gè)樣本中微生物多樣性[45]。利用Shannon指數(shù)等方法完成多樣性分析指數(shù)分析，探索沼液發(fā)酵樣品中微生物

豐度與發(fā)酵時(shí)間的相關(guān)性[46-47]。

2 結(jié)果分析

2.1 堿液秸稈預(yù)處理效果比較

秸稈質(zhì)量的變化和纖維素含量的變化可以直接反映整個(gè)預(yù)處理過(guò)程中秸稈結(jié)構(gòu)的破壞及降解程度，預(yù)處理前后玉米秸稈主要成分變化見表1。預(yù)處理后固體的失重率在4.5%～28.2%之間，對(duì)照組的失重率最低，堿液處理的失重率最高。堿液處理對(duì)木質(zhì)素、半纖維素有降解作用，可以很好去除木質(zhì)素的包裹作用，提高纖維素含量，對(duì)提高沼氣產(chǎn)量有很好的促進(jìn)作用。

表1 預(yù)處理前后玉米秸稈主要成分變化Table 1 Main contents variations of corn straw withpretreatment

2.2 不同微生物菌劑的產(chǎn)氣效果比較

沼氣發(fā)酵可以分析添加菌劑后的秸稈牛糞產(chǎn)沼氣潛力，整個(gè)厭氧消化周期為30 d，其沼氣日產(chǎn)率、累積產(chǎn)沼氣率、甲烷日產(chǎn)率及累積產(chǎn)甲烷率分別見圖1。

圖1 不同菌劑處理的沼氣和甲烷產(chǎn)量
Fig.1 Biogas and methane production from different microbial agents

沼氣日產(chǎn)率和甲烷日產(chǎn)率規(guī)律基本一致，均在2 d之內(nèi)開始產(chǎn)沼氣和甲烷，并在整個(gè)產(chǎn)氣周期內(nèi)出現(xiàn)4個(gè)產(chǎn)氣高峰。對(duì)照組的產(chǎn)氣率最低，添加菌劑1小組表現(xiàn)出較高的產(chǎn)沼氣及產(chǎn)甲烷率，最高沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率分別達(dá)到了72和39 mL/g VS。

由累積產(chǎn)氣及累積產(chǎn)甲烷率圖中可以看出，沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率均在前15 d快速上升，并達(dá)到最終產(chǎn)氣及產(chǎn)甲烷率的85%左右。添加菌劑1小組獲得最高的累積產(chǎn)沼氣及產(chǎn)甲烷率，最高累積產(chǎn)沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率分別達(dá)到了778和532 mL/g VS，而未添加菌劑的秸稈牛糞對(duì)照組的累積沼氣產(chǎn)率和累積甲烷產(chǎn)率分別為476、328 mL/g VS。添加微生物菌劑1，沼氣和甲烷產(chǎn)量提高效果最明顯，所以選擇產(chǎn)氣量最高的菌劑1處理進(jìn)行發(fā)酵各個(gè)階段的高通量分析。

2.3 OTU 聚類分析

為了研究沼液的微生物組成，將3個(gè)不同時(shí)期采集的樣品分別記為A05、A06和A07，按照 97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU 聚類分析。

細(xì)菌OUT數(shù)量如圖2-a所示，其中A05組共得到941個(gè)OTU，A06組共得到1 093個(gè)OUT，A07組共得到1 137個(gè)OUT。分別將這3組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，A05與A06共有的OTU為715個(gè)，A05與A07共有的OTU為707個(gè)，A06與A07共有的OTU 為865個(gè)。A05中特有的OTU為77個(gè)，A06中特有的OTU 為47個(gè)，A07中特有的OTU為80個(gè)。這3組的OTU 數(shù)一共為1 502個(gè)，它們共有的OTU 數(shù)為583個(gè)。

圖2 沼液樣品中細(xì)菌(a)和真菌(b) OTU數(shù)量的韋恩圖
Fig.2 Venn diagram of Bacteria (a) and fungal (b) OTU
number based on 16S rRNA gene sequence in biogas slurry

真菌OUT數(shù)量如圖2-b所示，其中A05組共得到819個(gè)OTU，A06組共得到830個(gè)OUT，A07組共得到866個(gè)OUT。分別將這3組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，A05與A06共有的OTU為376個(gè)，A05與A07共有的OTU 為388個(gè)，A06與A07共有的OTU 為426個(gè)。A05中特有的OTU為286個(gè)，A06中特有的OTU 為241個(gè)，A07中特有的OTU為257個(gè)。這3組的OTU 數(shù)一共為1 620個(gè)，它們共有的OTU 數(shù)為257個(gè)。

結(jié)果顯示，在發(fā)酵初期真菌和細(xì)菌類群最少，隨著菌劑的加入和發(fā)酵的進(jìn)行，微生物類群逐漸增多。不同發(fā)酵時(shí)期真菌特有的OUT數(shù)量要明顯大于細(xì)菌特有OUT數(shù)量，說(shuō)明在不同發(fā)酵時(shí)期真菌微生物變化要大于細(xì)菌微生物變化。

2.4 微生物多樣性稀釋性曲線

使用Mothur軟件做稀疏性曲線分析，用于驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。如圖3所示，發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌的豐度要大于真菌，微生物豐富程度為A07>A06>A05。真菌的OUT圖的平緩性更好，能很好反映樣本中絕大多數(shù)微生物多樣性信息，更好的展現(xiàn)了微生物的多樣性。

圖3 3個(gè)樣品細(xì)菌(a)和真菌(b)的稀釋曲線
Fig.3 Bacterium (a) and fungal (b) changes rarefaction
curve of three samples

2.5 微生物多樣性變化

表2 不同發(fā)酵階段微生物多樣性指數(shù)分析Table 2 Analysis of the bacterium and fungus diversityindex of the different stages

從表2結(jié)果來(lái)看，A07樣品細(xì)菌和真菌的Chao1豐富度指數(shù)最高，說(shuō)明物種數(shù)量最多。A05樣品細(xì)菌Shannon指數(shù)值最大，Simpson指數(shù)值最小，說(shuō)明該樣品細(xì)菌多樣性最豐富。A07樣品真菌Shannon 指數(shù)值最大，Simpson指數(shù)值最小，說(shuō)明該樣品真菌多樣性最豐富。Coverage數(shù)值均大于0.98，表明該指數(shù)本次測(cè)序結(jié)果較好的反映了樣本中細(xì)菌和真菌的真實(shí)情況。

2.6 沼氣發(fā)酵過(guò)程微生物變化

2.6.1 沼氣發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌門與屬的變化

在不同發(fā)酵時(shí)期采集發(fā)酵沼液進(jìn)行高通量測(cè)序，不同的細(xì)菌類群變化差異見圖4-a。擬桿菌門的數(shù)量最為豐富，是最主要的優(yōu)勢(shì)類群，在沼氣發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為增加，由發(fā)酵初期33.8%增加到發(fā)酵末期的43.6%；厚壁菌門是第二大優(yōu)勢(shì)類群，與擬桿菌門的變化趨勢(shì)相反，厚壁菌門(Firmicutes)隨著沼氣發(fā)酵的進(jìn)行，比例逐步減少，從發(fā)酵初期到發(fā)酵末期相對(duì)豐度由29.5%變?yōu)?2.3%；第三大類群為變形菌門(Proteobacteria)，豐度變化為16.8～22.5%，發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度的變化趨勢(shì)是不斷增加。同時(shí)，在發(fā)酵過(guò)程中涉及其他原核生物類群，如互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、螺旋體門(Spirochaetae)、放線菌門(Actinobacteria)等。

不同的細(xì)菌類群屬變化差異見圖4-b。擬桿菌門中vadinBC27_wastewater-sludge_group含量最豐富，是最主要的優(yōu)勢(shì)類群，在沼氣發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為增加，由發(fā)酵初期29.6%增加到發(fā)酵末期的35.9%，它是一種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)酸菌，該屬細(xì)菌不斷代謝發(fā)酵原料中殘留以及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的氨基酸，此菌屬還能夠代謝難降解有機(jī)物。互養(yǎng)菌門中的不能培養(yǎng)的Synergistaceae是第二大屬，該菌屬主要具有發(fā)酵氨基酸的功能，在去除沼氣發(fā)酵系統(tǒng)的中間代謝產(chǎn)物方面發(fā)揮重要作用，能發(fā)酵精氨酸、組氨酸和甘氨酸等氨基酸并產(chǎn)生甲酸、乙酸、丙酸、H2和NH3，也能降解吡啶二醇等難降解有機(jī)物，相對(duì)豐度由發(fā)酵初期12.3%降到到發(fā)酵末期的8.1%。變形菌門中的Pseudomonas是第三大屬，Pseudomonas是水解菌屬，可以降解原料中的纖維素成分，前期原料充足，Pseudomonas含量比較高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，原料逐漸被利用，相對(duì)豐度由發(fā)酵初期9.8%降到到發(fā)酵末期的3.7%。

圖4 門(a)和屬(b)水平上前10名細(xì)菌的相對(duì)豐度
Fig.4 Relative abundance of the top bacteria at the
level of Phylum and Genus

2.6.2 沼氣發(fā)酵過(guò)程真菌門與屬變化

不同的真菌類群變化差異見圖5-a。子囊菌門(Ascomycota)的數(shù)量最為豐富，是最主要的優(yōu)勢(shì)類群，在沼氣發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為先增加后降低，由發(fā)酵初期65.7%增加到發(fā)酵中期的84.7%，又降到發(fā)酵末期的66.8%；擔(dān)子菌門(Basidiomycota)是第二大優(yōu)勢(shì)類群，與子囊菌門的變化趨勢(shì)相反，擔(dān)子菌門隨著沼氣發(fā)酵的進(jìn)行，比例先減少后增多，從發(fā)酵初期到發(fā)酵末期相對(duì)豐度由5.3%變?yōu)?.1%。同時(shí)，在發(fā)酵過(guò)程中涉及其他真核生物類群，如鞭毛菌門(Mortierellomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、單孢菌門(Monoblepharomycota)等。

不同的真菌類群屬變化差異見圖5-b。子囊菌門中塊菌屬(Tuber)含量最豐富，是最主要的優(yōu)勢(shì)類群，它是一種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)糖菌，該屬細(xì)菌產(chǎn)生的糖類物質(zhì)可以為后續(xù)沼氣發(fā)酵提供原料，此菌屬豐度變化與沼氣產(chǎn)量相一致。在沼氣發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為先增加后降低，由發(fā)酵初期0.2%增加到發(fā)酵中期的51.7%，又降低到發(fā)酵末期的36.5%。子囊菌門中的枝氯霉屬(Ramichloridium)是第二大屬，該菌屬主要具有水解纖維素的功能，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，原料逐漸被利用，相對(duì)豐度不斷下降，由發(fā)酵初期11.6%降到到發(fā)酵末期的4.7%。

圖5 門(a)和屬(b)水平上前10名真菌的相對(duì)豐度
Fig.5 Relative abundance of the top fungus at the
level of Phylum and Genus

2.7 微生物多樣性聚類分析heatmap圖

從圖6可以看出，多樣性聚類分析A06和A07比較接近，而A05則與其他2個(gè)樣品差距較大，說(shuō)明沼液發(fā)酵初期微生物的菌屬有很大變化，沼液發(fā)酵中后期微生物的菌屬變化不大。細(xì)菌前期主要是以假單胞菌、孢子菌主，發(fā)酵中期以擬桿菌為主，發(fā)酵后期為嗜角菌屬。真菌前期主要是以馬拉色菌、鏈格孢、短梗霉屬為主，發(fā)酵中后期以塊菌屬為主。

圖6 基于屬水平上的細(xì)菌(a)和真菌(b)聚類分析熱圖
Fig.6 Based on the genus level of Bacterial and
Fungus clustering analysis Heatmap

3 討論

在正常產(chǎn)氣的沼液中，存在著種群繁多的微生物，目前針對(duì)沼液中微生物分析主要采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)研究，但是微生物界約有99%的微生物是不能進(jìn)行純培養(yǎng)的，會(huì)遺漏許多重要的沼液微生物學(xué)信息，因此無(wú)法來(lái)揭示沼液中微生物群落的全部生態(tài)信息。高通量測(cè)序技術(shù)作為一種無(wú)需微生物分離培養(yǎng)的快速檢測(cè)技術(shù)，能夠?qū)悠分械娜课⑸镞M(jìn)行種類和豐度鑒定，分析添加菌劑對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，對(duì)于提高沼氣工程發(fā)酵效果，乃至開發(fā)新型沼氣工程菌劑都具有重要的意義。

如圖4和圖5可知，在細(xì)菌門中擬桿菌門與變形菌門之間呈顯著的正相關(guān)性，與厚壁菌門之間呈極顯著的負(fù)相關(guān)性。發(fā)酵過(guò)程中厚壁菌門豐度不斷減少，這與滑留帥等[37]研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)與其不同的是中擬桿菌門豐度一直處于增加狀態(tài)。在沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中，可利用的有機(jī)質(zhì)原料不斷減少，導(dǎo)致厚壁菌門的代謝活動(dòng)減弱，相對(duì)豐度也相應(yīng)減少。厚壁菌門的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)與沼氣發(fā)酵系統(tǒng)的原料變化基本一致，表明這類群的代謝活動(dòng)對(duì)沼氣發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氣效率影響大。

微生物自制菌劑添加后，激活了細(xì)菌假單胞菌屬(Pseudomonas)和真菌中塊菌屬和枝氯霉屬的水解能力，大量纖維素被降解，為產(chǎn)乙酸菌提供了糖類物質(zhì)，vadinBC27_wastewater-sludge_group和Synergistaceae大量生長(zhǎng)，為產(chǎn)甲烷菌提供乙酸和甲酸等物質(zhì)，增加了沼氣發(fā)酵系統(tǒng)沼氣的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同微生物菌劑添加對(duì)牛糞-玉米秸稈聯(lián)合沼氣發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示微生物菌劑配比為蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質(zhì)量比3∶2∶3∶2)時(shí)產(chǎn)氣效果最好，在此條件下最高沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率分別達(dá)到了72、39 mL/g VS，最高累積產(chǎn)沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率分別達(dá)到了778、532 mL/g VS。

對(duì)添加最優(yōu)微生物菌劑配比的沼氣發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，細(xì)菌中的擬桿菌門的數(shù)量最為豐富，是最主要的優(yōu)勢(shì)類群，在沼氣發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為增加，由發(fā)酵初期33.8%增加到發(fā)酵末期的43.6%；真菌中子囊菌門的數(shù)量最為豐富，是最主要的優(yōu)勢(shì)類群，在沼氣發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為先增加后降低，由發(fā)酵初期65.7%增加到發(fā)酵中期的84.7%，又降到發(fā)酵末期的66.8%。

高通測(cè)序結(jié)果顯示細(xì)菌擬桿菌門中vadinBC27_wastewater-sludge_group含量最豐富，是最主要的優(yōu)勢(shì)類群，在沼氣發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為增加，由發(fā)酵初期29.6%增加到發(fā)酵末期的35.9%。互養(yǎng)菌門中的不能培養(yǎng)的Synergistaceae是第2大屬，該菌屬主要具有發(fā)酵氨基酸的功能，相對(duì)豐度由發(fā)酵初期12.3%降到到發(fā)酵末期的8.1%。變形菌門中的Pseudomonas是第3大屬，Pseudomonas是水解菌屬，相對(duì)豐度由發(fā)酵初期9.8%降到到發(fā)酵末期的3.7%。真菌子囊菌門中塊菌屬含量最豐富，是最主要的優(yōu)勢(shì)類群，它是一種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)糖菌，在沼氣發(fā)酵過(guò)程中的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為先增加后降低，由發(fā)酵初期0.2%增加到發(fā)酵中期的51.7%，又降低到發(fā)酵末期的36.5%。子囊菌門中的枝氯霉屬是第2大屬，該菌屬主要具有水解纖維素的功能，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，原料逐漸被利用，相對(duì)豐度不斷下降，由發(fā)酵初期11.6%降到到發(fā)酵末期的4.7%。

本試驗(yàn)通過(guò)研究牛糞-玉米秸稈聯(lián)合沼氣發(fā)酵的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，揭示高產(chǎn)沼氣發(fā)酵池的微生物群落結(jié)構(gòu)特征，為牛糞-玉米秸稈聯(lián)合沼氣發(fā)酵菌劑制備提供理論依據(jù)。