朱佩琪, 蔣偉東, 周 諾*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究自治區(qū)級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021；4.頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，南寧 530021)

近幾十年來(lái)基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，通過(guò)操縱宿主基因組中的功能性DNA序列進(jìn)行基因組編輯是生物醫(yī)學(xué)研究的基本策略。RNA干擾(RNA interference，RNAi)和工程DNA結(jié)合蛋白技術(shù)(鋅指核酸酶 zinc finger nucleases，ZFN或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 transcription activator-like effector nucleases，TALEN)是靶向基因調(diào)控的強(qiáng)大技術(shù)[1]。RNAi是目前遺傳學(xué)方法中應(yīng)用較廣泛，并且具有操作簡(jiǎn)單、效果顯著的優(yōu)點(diǎn)，但該技術(shù)具有一定的局限性，不能作用于所有基因和某些細(xì)胞類型(如神經(jīng)元)，還有顯著的脫靶效應(yīng)、具有毒副作用等缺點(diǎn)。后續(xù)發(fā)展的第一、第二代人工核酸酶技術(shù)即ZFN技術(shù)和TALENS在基因編輯效率以及脫靶率上得到明顯改進(jìn)，但是作為定制的DNA結(jié)合蛋白，他們對(duì)操作者的專業(yè)能力要求高，成本較高[2]。直到2013年初，一種全新的基因組定點(diǎn)改造技術(shù)被開(kāi)發(fā)，即為CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated protein 9)，這一技術(shù)為在各種生物體中進(jìn)行基因組編輯打開(kāi)了使用RNA導(dǎo)向的核酸酶的大門[3]。與其他的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9具有操作方便、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、效率高、成本低以及可同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)編輯等優(yōu)勢(shì)。目前該系統(tǒng)為研究基因功能和生物進(jìn)展提供更為理想的方法和先進(jìn)的動(dòng)物模型，極大的促進(jìn)了各種疾病在體內(nèi)條件下的研究。本文綜合論述了CRISPR/Cas9的作用機(jī)理、發(fā)展歷史及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，為更好地挖掘出CRISPR/Cas9在疾病治療方面的潛力提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)研究歷史

1987年，Ishino等[4]在研究大腸桿菌中l(wèi)ap酶參與的堿性磷酸酶的同工酶轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)的iap基因，是可以追溯到的關(guān)于CRISPR的最早報(bào)道。iap基因包含一段十分獨(dú)特的29nt重復(fù)序列，這些序列以串聯(lián)的形式重復(fù)出現(xiàn)，并被5個(gè)32 nt的非重復(fù)序列間隔開(kāi)。接下來(lái)，越來(lái)越多的細(xì)菌和古細(xì)菌基因組被測(cè)序并被鑒定出CRISPR序列。大量的數(shù)據(jù)表明，大約有40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌基因組含有這一獨(dú)特的序列[5]。直到2002年，這一獨(dú)特的重復(fù)串聯(lián)序列家族正式被命名為CRISPR，取自的它的英文全稱Clustered regularly interspaced short palindromic repeats首字母縮寫[6]。同時(shí)，CRISPR系統(tǒng)相關(guān)基因(CRISPR-associated genes，Cas)也被鑒定出來(lái)[6]，它們具有一定的保守性。據(jù)此，研究人員將CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行了大致分類,確定了CRISPR/Cas系統(tǒng)的三種主要類型，其中Cas3、Cas9(formerlycsn1)和Cas10分別是I型、II型和III型系統(tǒng)的標(biāo)簽基因。2005年，有研究發(fā)現(xiàn)CRISPR序列與細(xì)菌的適應(yīng)性免疫功能相關(guān)[7-8]。2007年，丹麥的食品添加劑公司Danisco 的Horvath 等[9]發(fā)現(xiàn)CRISPR具有抵抗特定噬菌體針對(duì)嗜熱鏈球菌的感染的功能，這是第一個(gè)證實(shí)CRISPR與適應(yīng)性免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也是II型CRISPR系統(tǒng)作為一個(gè)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。由于I型和III型相對(duì)復(fù)雜，CRISPR功能活性需要多種蛋白質(zhì)配合進(jìn)行。而II型CRISPR/Cas系統(tǒng)中涉及到的Cas蛋白最少，通常被認(rèn)為是最小的CRISPR/Cas系統(tǒng)，僅包括CRISPR重復(fù)-間隔序列和3～4個(gè)cas基因。其中，Cas9基因是一個(gè)大分子量的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，能夠獨(dú)自起到靶向和裂解侵入DNA的功能。此后的十多年里，諸多研究者把目光投向II型CRISPR/Cas系統(tǒng)。2009年后，CRISPR系統(tǒng)的基本功能和機(jī)制逐漸清晰，隨后許多研究小組已開(kāi)始將自然的CRISPR 系統(tǒng)應(yīng)用于各種生物技術(shù)。自2013年首次將CRISPR/Cas9應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因編輯后，這一領(lǐng)域的研究發(fā)展十分迅速，目前這一系統(tǒng)已經(jīng)在人類細(xì)胞、猴子、豬、小鼠、斑馬魚、果蠅、酵母、植物、秀麗隱桿線蟲以及細(xì)菌等基因工程領(lǐng)域成功使用。CRISPR/Cas系統(tǒng)在各種細(xì)胞和生物體中進(jìn)行基因組編輯的通用性和高效性證明了該系統(tǒng)的在基因改造領(lǐng)域的巨大優(yōu)勢(shì)，使其成為高效、便捷精準(zhǔn)的新一代基因編輯工具。本文中，筆者總結(jié)了CRISPR發(fā)展的簡(jiǎn)略時(shí)間表(圖1)。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究歷史Figure 1 History of CRISPR/Cas9 technology

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯過(guò)程

CRISPR/ Cas9介導(dǎo)的基因組編輯依賴于雙鏈DNA斷裂(double strand breaks，DSB)和隨后的細(xì)胞DNA修復(fù)過(guò)程。在內(nèi)源性CRISPR/ Cas9系統(tǒng)中，首先，由成熟crRNA與反式激活crRNA(tracrRNA)結(jié)合形成sgRNA(tracrRNA-crRNA復(fù)合物)，該復(fù)合物負(fù)責(zé)將Cas9引導(dǎo)至目標(biāo)位點(diǎn)。其中，tracrRNA與crRNA部分互補(bǔ)，并參與crRNA成熟過(guò)程，而另一部分序列(5’末端約20 nt)與靶向序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。CRISPR/ Cas9介導(dǎo)的序列特異性切割要求crRNA與靶向序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)和一段短的原間隔序列相鄰基序(Protospacer adjacent motif，PAM)。與靶位點(diǎn)結(jié)合后，與crRNA的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈分別被Cas9切割，在靶點(diǎn)位置產(chǎn)生DSB(圖2)。該過(guò)程中，Cas9 蛋白中 HNH 結(jié)構(gòu)域剪切目標(biāo)鏈，而Rucv結(jié)構(gòu)域切割非目標(biāo)鏈。最后，由CRISPR/ Cas9產(chǎn)生的DSB將觸發(fā)細(xì)胞DNA修復(fù)過(guò)程，包括非同源末端連接(NHEJ)介導(dǎo)的易錯(cuò)DNA修復(fù)和同源定向修復(fù)(HDR)介導(dǎo)的無(wú)錯(cuò)誤DNA修復(fù)(圖2)。

其中，NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)可以快速連接DSB，但在靶位點(diǎn)產(chǎn)生小的插入和缺失突變。這些突變就可以幫助各相關(guān)領(lǐng)域研究人員對(duì)靶基因或基因組元件進(jìn)行插入和缺失的編輯。例如，Gratz等[26]通過(guò)NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)，通過(guò)CRISPR/ Cas9誘導(dǎo)的DNA切割在果蠅基因組的黃色基因座處產(chǎn)生了移碼突變。DSB也可以啟動(dòng)HDR介導(dǎo)的DNA修復(fù)，這比NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)更復(fù)雜。HDR介導(dǎo)的無(wú)錯(cuò)誤DNA修復(fù)需要含有同源性的供體DNA序列作為修復(fù)模板。通過(guò)共同注射Cas9,兩種指導(dǎo)RNA(gRNA)分別靶向黃色基因座的5’和3’序列以及單鏈寡聚脫氧核苷酸模板，Gratz等人用果蠅基因組中的50nt attP重組位點(diǎn)成功替換了黃色基因座[26]。

為了便于在基因組編輯中應(yīng)用，研究人員設(shè)計(jì)了一種精密的gRNA，它是一種含有所有必需crRNA和tracrRNA成分的嵌合RNA[27]。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種CRISPR/Cas9變體，包括能夠識(shí)別20或24 nt的gRNA和位于靶點(diǎn)位置的2～4 nt PAM序列。理論上CRISPR/Cas9可以靶向22～29 nt的特定DNA序列，這在大多數(shù)基因組中能夠保證靶點(diǎn)的特異性。然而，最近的研究觀察到CRISPR/Cas9對(duì)gRNA和其互補(bǔ)靶序列之間的堿基對(duì)錯(cuò)配具有高度耐受性，導(dǎo)致該系統(tǒng)在應(yīng)用中存在較高的脫靶效應(yīng)[27-29]。

與ZFN和TALEN相比，CRISPR/ Cas9有幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)。ZFNs和TALENs建立在蛋白質(zhì)引導(dǎo)的DNA切割的基礎(chǔ)上，這需要復(fù)雜和耗時(shí)的蛋白質(zhì)工程，選擇和驗(yàn)證。相比之下，CRISPR/Cas9只需要一個(gè)短的可編程gRNA進(jìn)行DNA定位，相對(duì)便宜且易于設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。通過(guò)使用Cas9和幾種不同靶位點(diǎn)gRNA，CRISPR/Cas9能夠在多個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)同時(shí)誘導(dǎo)基因組修飾。該技術(shù)可以加速產(chǎn)生具有多個(gè)基因突變的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[27]，并破壞一個(gè)或數(shù)個(gè)基因以研究基因功能。

圖2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯示意圖Figure 2 Mechanism of CRISPR/Cas9

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

大量的研究證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以快速方便地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，動(dòng)物模型或其他物種中實(shí)現(xiàn)基因組編輯[28-35]。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被視為基因治療的有希望的候選者。

3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于抗腫瘤免疫治療

腫瘤發(fā)生是由多種基因改變所驅(qū)動(dòng)的，并且總是與復(fù)雜的免疫反應(yīng)有關(guān)，其涉及腫瘤細(xì)胞的免疫逃避和免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的產(chǎn)生[36]。隨著諸多免疫檢查點(diǎn)的確定，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)和程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)，近年來(lái)，抗腫瘤免疫治療已經(jīng)成為備受矚目的防治癌癥的策略之一[37-38]。通過(guò)對(duì)患者的免疫細(xì)胞進(jìn)行基因編輯抗腫瘤免疫治療無(wú)疑是一個(gè)富有希望的研究方向。

在腫瘤中已經(jīng)獲得良好的臨床結(jié)果的一種方法是免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如阻斷CTLA-4，PD-1及其配體PDL-1。已有大量研究表明CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PD-1[39]，PDL-1[40]或CTLA-4[41]基因敲除是打破腫瘤治療中基于T細(xì)胞的過(guò)繼療法耐受性的有效策略。2016年一篇文獻(xiàn)報(bào)道，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)滅活PD-1來(lái)設(shè)計(jì)癌癥患者的T細(xì)胞的兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，分別在美國(guó)和中國(guó)進(jìn)行[42]。

此外，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯在基因治療中最具前景的應(yīng)用之一是CAR T細(xì)胞的產(chǎn)生。CAR通常含有識(shí)別和結(jié)合特定腫瘤相關(guān)抗原的胞外單鏈可變片段和驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞活化的細(xì)胞內(nèi)嵌合信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域[43]。作為一種新型的基因治療方法，CAR T細(xì)胞療法，尤其是CD19特異性CAR T細(xì)胞療法在治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病[44]和非霍奇金淋巴瘤[45]中顯示出顯著的抗腫瘤活性。然而，臨床研究中發(fā)現(xiàn)這種治療具有體內(nèi)神經(jīng)毒性，并可能引起細(xì)胞因子釋放綜合征[44-45]。此外，目前進(jìn)行的CAR T細(xì)胞臨床試驗(yàn)主要是通過(guò)收集患者的T細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行基因修飾，在將它們送回患者體內(nèi)，從而達(dá)到治療目的。但這種方式對(duì)醫(yī)療設(shè)備和技術(shù)人員的技術(shù)要求極高，更重要的是，想要從患有嚴(yán)重疾病的患者身上獲得足夠功能完整的自體細(xì)胞也是十分困難的。這些都極大地限制了這一技術(shù)在臨床上的推廣應(yīng)用。為了克服這些障礙，通過(guò)編輯來(lái)自一個(gè)供體的同種異體T細(xì)胞制造出“通用”CAR T細(xì)胞，然后施用給多個(gè)其他患者，已經(jīng)成為新的研究方向。研究表明，使用CRISPR-Cas9將CD19特異性CAR靶向T細(xì)胞受體α保守(T-cell receptor a constant，TRAC)位點(diǎn)不僅可以在人外周血T細(xì)胞中產(chǎn)生均一的CAR表達(dá)，還可以增強(qiáng)T細(xì)胞的活性，大大優(yōu)于傳統(tǒng)的在ALL的小鼠模型中產(chǎn)生CAR T細(xì)胞[46-47]。然而，同種異體T細(xì)胞上的內(nèi)源性αβ T-細(xì)胞受體(αβ T-cell receptor，TCR)可能識(shí)別受體中的組織相容性抗原，導(dǎo)致移植物抗宿主病，且同種異體T細(xì)胞表面表達(dá)人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)往往會(huì)觸發(fā)宿主快速免疫排斥反應(yīng)。這成為了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開(kāi)發(fā)“通用”CAR T細(xì)胞的一大挑戰(zhàn)。

雖然仍然存在一些挑戰(zhàn)，但基因編輯和腫瘤免疫治療方面的巨大進(jìn)步使其成為人類疾病基因治療的有希望的方法。許多科研工作者相信，在提高該方法的安全性并降低脫靶率后，該系統(tǒng)可以迅速應(yīng)用于臨床腫瘤治療。

3.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于病毒性疾病治療

由于病毒突變率高和潛伏感染，病毒引起的疾病難以治療，尤其是人類宿主中的潛伏病毒幾乎是不可能被消滅的。近年來(lái)，基因治療成了治療病毒性疾病的新寵。CRISPR/ Cas系統(tǒng)起源于古細(xì)菌和細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，賦予其對(duì)外源遺傳元件如質(zhì)粒和病毒(噬菌體)的抗性，并為宿主提供獲得性免疫[48-49]。

目前常用的抗病毒藥物的作用機(jī)制主要是阻斷病毒復(fù)制周期，比如阻斷病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞或是阻礙病毒的基因組復(fù)制等。但是這一治療的缺陷是只能在病毒進(jìn)入復(fù)制周期時(shí)起作用，無(wú)法消滅潛伏期病毒。因此，制定出能夠破壞病毒基因組的治療策略，是抗病毒治療領(lǐng)域十分值得研究的方向之一。借助CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)病毒基因組進(jìn)行編輯，可以達(dá)到這一效果。2016年，有研究者設(shè)計(jì)了針對(duì)ICP0的sgRNA，用以治療HSV-1感染[23]，這是一種重要的病毒編碼蛋白，可調(diào)節(jié)HSV-1病毒基因的表達(dá)和復(fù)制。同年，Diemen等[24]利用CRISPR/ Cas9技術(shù)來(lái)抑制皰疹病毒在潛伏感染和裂解感染模型中的復(fù)制。這項(xiàng)研究顯示CRISPR系統(tǒng)能夠抑制三種皰疹病毒家族成員：EBV，HSV和HCMV[24]。2018年一項(xiàng)研究報(bào)道中描述研究人員設(shè)計(jì)了RNA引導(dǎo)的CRISPR/ Cas9靶向HIV-1調(diào)節(jié)基因tat和rev，并選擇了基于六種主要HIV-1亞型的CRISPR特異性和序列保守性的gRNA。然后在持續(xù)和潛伏的HIV-1感染的T細(xì)胞系中進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果顯示CRISPR/Cas9在持續(xù)和潛伏感染的人CD4 + T細(xì)胞系中能夠成功抑制HIV-1復(fù)制[25]。

雖然目前在藥物研發(fā)方面已然取得了巨大的成就，現(xiàn)有的治療方案包括小分子藥物(如siRNA)，抗病毒藥物，蛋白酶抑制劑和預(yù)防性疫苗。然而對(duì)于許多持續(xù)性、潛伏期長(zhǎng)、高復(fù)發(fā)性或是高度流行的病毒仍然缺乏有效的治療方案，病毒治療領(lǐng)域仍有許多未被攻克的領(lǐng)域。CRISPR/ Cas9技術(shù)的發(fā)展為治療潛伏性皰疹病毒感染提供了一種新穎而有前景的策略。盡管這一方案的有效性和安全性仍然需要更多的臨床前研究數(shù)據(jù)來(lái)證明，但不可否認(rèn)的是，CRISPR/ Cas9仍然有潛力成為針對(duì)病毒感染的有效療法。

3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于遺傳性疾病治療

在完成人類基因組計(jì)劃以后，醫(yī)學(xué)正迅速發(fā)展成為基因組醫(yī)學(xué)學(xué)科。盡管目前許多疾病距離基因治療仍十分遙遠(yuǎn)，但是在過(guò)去25年中，人類對(duì)各類疾病發(fā)病機(jī)制的知識(shí)積累，尤其是許多疾病的遺傳基礎(chǔ)的了解達(dá)到了指數(shù)增長(zhǎng)，尤其是許多無(wú)法治愈的遺傳性疾病。許多研究者認(rèn)為，糾正這些疾病相關(guān)的點(diǎn)突變同時(shí)保留遺傳功能的策略是治療遺傳疾病的理想方法。CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)Cas9在突變位點(diǎn)處或附近引入DNA DSBs，然后通過(guò)NHRJ或HDR誘導(dǎo)不同類型的插入，導(dǎo)致基因突變，敲入，刪除，反轉(zhuǎn)等，在這一過(guò)程中有機(jī)會(huì)糾正基因組中相應(yīng)缺陷，從而達(dá)到治療遺傳疾病的效果。

2014年，Yin等[50]報(bào)道了一項(xiàng)在成年小鼠體內(nèi)進(jìn)行的CRISPR/ Cas9介導(dǎo)的HDR糾正Fah基因點(diǎn)突變的研究，證明了利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯糾正基因突變?cè)诔赡陝?dòng)物中是可行的，并且具有糾正人類遺傳疾病的潛力。這種策略也被應(yīng)用于其他類似遺傳疾病的研究，如Yang等[51]利用同樣的技術(shù)成功校正了小鼠Otc基因外顯子4的G→A點(diǎn)突變，證實(shí)了該療法對(duì)新生小鼠高氨血癥的治療效果。此外，HDR介導(dǎo)的點(diǎn)突變校正也已應(yīng)用于包括β-地中海貧血[52]，慢性肉芽腫病[53]，Duchenne肌肉萎縮癥[54]，鐮狀細(xì)胞病[55]和嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷[56]。國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究也十分令人矚目，已將CRISPR/ Cas9技術(shù)應(yīng)用于大鼠、小鼠、豬、猴等各類動(dòng)物模型[57-61]。如可用于Abcb1基因相關(guān)藥物代謝研究的Abcb1基因敲除大鼠和人源化大鼠模型[57]，Rag2、IL2rg基因突變的T、B及NK細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷BABL/c小鼠[58]，用于2型糖尿病研究的Irs1 基因敲除大鼠[59]，用于癌癥研究的基因修飾工具豬模型[60]。此外，在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型[61]的建立上CRISPR/Cas9技術(shù)也有巨大的潛力，可以預(yù)測(cè)CRISPR/Cas9技術(shù)能夠使靈長(zhǎng)類動(dòng)物成為各相關(guān)領(lǐng)域研究人員研究重大神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及疾病的早期干預(yù)和藥物篩選的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

CRISPR/Cas9技術(shù)為靶向基因編輯提供了強(qiáng)有力的工具，并且已經(jīng)在遺傳疾病的治療發(fā)展中展現(xiàn)出其強(qiáng)大的潛力。無(wú)論是在體外實(shí)驗(yàn)還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用CRISPR/Cas9技術(shù)來(lái)校正基因缺陷已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，使得治療性基因編輯有望應(yīng)用于臨床。同時(shí)，在臨床應(yīng)用中該技術(shù)的使用也需要考慮療效、準(zhǔn)確性、安全性以及倫理問(wèn)題。

4 天使或魔鬼？——風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題

實(shí)際上，“基因療法”并非CRSIPR技術(shù)出現(xiàn)后才被提出的概念。早在1990年，美國(guó)就批準(zhǔn)了人類第一個(gè)對(duì)遺傳病進(jìn)行體細(xì)胞基因治療的方案，將腺苷脫氨酶基因(ADA)導(dǎo)入兩名患有嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷綜合征(SCID)的兒童T細(xì)胞中[62]。然而，隨著在1999年，一位在賓夕法尼亞大學(xué)接受基因治療實(shí)驗(yàn)的18歲患者，在實(shí)驗(yàn)期間出現(xiàn)多器官功能衰竭后死亡，敲響了第一個(gè)質(zhì)詢“基因療法是否安全”的警鐘[63]。此后幾年內(nèi)，基因療法的臨床試驗(yàn)一再出現(xiàn)安全問(wèn)題。最終，基因療法臨床試驗(yàn)暫停，幾乎不再有人提及。直至2015年，借助TALEN基因編輯技術(shù)，倫敦大奧蒙德街醫(yī)院一位1歲大女嬰Layla Richards的白血病被“治愈”[64]。不過(guò)，這一病例中研究人員只是對(duì)健康捐獻(xiàn)者的T細(xì)胞某些引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)的基因進(jìn)行了刪除，以防止這些外來(lái)T細(xì)胞被病人自身的免疫系統(tǒng)和抗癌藥物的攻擊，從而提升女嬰的免疫能力，爭(zhēng)取更多的治療時(shí)間。正如她的主治醫(yī)生所說(shuō)，只是起到了“橋梁”作用，最終想要治愈還是需要進(jìn)行骨髓移植。然而，全球首例利用基因療法“治愈”的白血病，仍然給科學(xué)界帶來(lái)了極大的鼓舞。而CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展更是在技術(shù)上實(shí)現(xiàn)了巨大的突破，似乎基因療法就在眼前。

但是，CRISPR/Cas9技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題，也不容忽視。今年6月11日，Nature子刊NatureMedicine上同期發(fā)表的兩篇在人多能干細(xì)胞中進(jìn)行相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[65-66]：CRISPR基因編輯造成的DNA雙鏈斷裂會(huì)激活p53，引起人多能干細(xì)胞的凋亡。而p53是重要的抑癌基因，這意味著最后被“篩選”出來(lái)的細(xì)胞，極有可能是存在p53功能缺陷的細(xì)胞，這就使得患者處于癌癥風(fēng)險(xiǎn)之中。雖然目前尚無(wú)直接實(shí)驗(yàn)證實(shí)其致癌性，但是這一研究結(jié)果再一次為CRISPR/Cas9應(yīng)用于臨床治療敲響了警鐘。這也再一次提醒了大家，在應(yīng)用于人體之前，CRISPR還有很長(zhǎng)的一段路要走。

5 總結(jié)與展望

目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)憑借其明顯優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成為基因編輯系統(tǒng)的焦點(diǎn)，且該技術(shù)用于靶向基因組編輯和調(diào)控的應(yīng)用正在不斷增長(zhǎng)，并擴(kuò)展到更廣泛的生物體和細(xì)胞類型。作為現(xiàn)代科學(xué)中革命性的基因組編輯技術(shù)，它可以作為工具建立動(dòng)物模型，糾正缺陷性致病基因，消除病毒/細(xì)菌感染，治療癌癥和重新編程神經(jīng)元細(xì)胞。目前，科研工作者們已經(jīng)能夠成功地利用該技術(shù)為研究特定基因的功能建立疾病模型。在器官移植領(lǐng)域、病毒類疾病以及遺傳類疾病方面，該技術(shù)也已有了明顯的突破。相信CRISPR/Cas9技術(shù)在今后的基礎(chǔ)研究和臨床治療中能夠取得更大的突破，大放異彩。但不可忽視的是，任何基礎(chǔ)研究中獲得的研究成果，想要應(yīng)用于臨床治療，都還需要大量的研究，既要保證保證安全性，也要保證有效性。