鄭 躍，劉 麗，劉建秋

(黑龍江中醫(yī)藥大學， 哈爾濱 150040)

中醫(yī)對于疾病的診斷基礎是證候，不同的證候表現(xiàn)為人體對于疾病的全身整體反應，是辨證的結果，同時更是論治的依據(jù)。傳統(tǒng)的中醫(yī)建立在醫(yī)家的思辨基礎上，由于目前病證模型相結合的方法較少，單一從病上論治其有效性，而忽視辨證，并不能完整的體現(xiàn)中藥治療的價值，而一直以來，將復雜的中醫(yī)辨證理論轉化為臨床上更直觀的指標數(shù)據(jù)都是中醫(yī)藥發(fā)展的瓶頸所在[1]。為了更好地研究輸卵管炎的發(fā)病機制和其分型的病癥表現(xiàn)，本實驗將病與證的模型相結合，通過對大鼠模型的標準化、客觀化、計量化的采集和分析，從而建立與臨床表現(xiàn)相類似的氣滯血瘀型慢性輸卵管炎癥模型大鼠，進而加深中醫(yī)藥對輸卵管炎等婦科疾病的探索，為治療該領域疾病提供科學理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性SPF級SD大鼠52只，8～12周，體重(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證編號[SCXK(黑) 2015-004]，實驗動物使用許可證號[SYXK(黑)2013-012]。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物管理和使用委員會審核，符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》和《實驗動物使管理和使用委員會章程》 的相關規(guī)定，實驗動物倫理審查批準編號 DWLL20151108001。保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度22℃，相對濕度40%左右，每日早8:00到晚8:00人工燈光照明，飼養(yǎng)密度為每盒5只，籠具交換1周1次，每3 d全部作業(yè)結束后，由動物室人員進行清掃并擦拭消毒，并更換鼠盒及墊料。標準大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應環(huán)境一周之后開始實驗。

1.2 主要試劑與儀器

電子天平(北京賽多利儀器有限公司)、HNY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器(天津歐諾儀器儀表有限公司)、EG1160 石蠟包埋機(德國 LEICA 技術公司)、BM-2135石蠟切片機(德國 LEICA 技術公司)、CS Ⅲ生物組織攤片機(湖北省醫(yī)用電子儀器廠)、CX41光學顯微鏡(日本 OLYMPUS 公司)、JEM-1220型透射電鏡(日本電子有限公司)、HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(武漢同濟醫(yī)科大學千屏影像工程公司)。GRT-6008全自動血液分析儀器(濟南格利特科技有限公司)、LBY-N6 Compact全自動血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)、LBY-BX型紅細胞變形聚集儀(北京普利生儀器有限公司)。

金黃色葡萄球菌(菌號ATCC29213)FSCC225002(購自北京東方賽瑞生物技術有限公司)、二甲苯(天津市永大化學試劑有限公司，批號160107)、伊紅(天津科密歐化學試劑開發(fā)中心，批號150927)、蘇木素(上海山浦化工有限公司，批號150424)、純凈水(廣州屈臣氏食品飲料公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)與菌液配制

將35 g牛肉湯培養(yǎng)基，加入到1000 mL的蒸餾水中溶解， 121℃滅菌20 min，放冷，取斜面保存的金黃色葡萄球菌菌種，用無菌蒸餾水溶解，在超凈工作臺下接種至新配制的液體培養(yǎng)基中，于28℃，110 r/min，搖床培養(yǎng)24～48 h，得到菌液即可使用。

1.3.2 分組與模型構建[2-3]

雌性SD大鼠52只，隨機分為4組，分別為空白組(K)、手術組(S)、模型組(M)、復合模型組(F)，每組13只。于實驗第1天，除K組外，其余各組麻醉后，將大鼠側臥式平放，剃毛并用碘伏進行消毒，取肋緣過腎區(qū)0.5 cm近脊柱側旁開1 cm長的橫切口，打開腹腔，撥開其他組織，暴露一側卵巢、輸卵管及部分子宮，M組、F組均向輸卵管方向注入已配好的4×109/mL金黃色葡萄球菌懸液0.1 mL，后逐層縫合腹壁肌層、皮膚，再以75%的酒精消毒切口，另一側輸卵管同樣方法操作，S組只手術不注菌，注入等劑量生理鹽水(見表1)。

于實驗第8天，復合模型組(F)給予大鼠不可預知的慢性長期刺激，包括大鼠足底25～35 V的電擊刺激，每隔8～15 min進行一次，每次60～120 s，持續(xù)10～12 h；頻率為5～15 KHz的噪聲刺激(等級為3級)，每隔8～15 min進行一次，每次60～120 s，持續(xù)10～12 h；頻率為1～3 KHz強度的閃爍光刺激，每隔8～15 min進行一次，每次60～120 s，持續(xù)10～12 h；夾尾每小時1次，每次4 min，每天8次；45°傾斜鼠籠兩小時，每日1次；連續(xù)21 d。

1.3.3 大鼠體重、攝食量

實驗過程中各組大鼠每7 d分別測量一次體重與飲食量。

1.3.4 大鼠一般行為學觀察

實驗過程中各組大鼠每7 d分別進行一般行為學記錄，包括活動量、精神、舌色、爪色、耳色。

1.3.5 大鼠癥候積分

根據(jù)表2 氣滯血瘀模型大鼠的癥候積分評價量表評價大鼠證候積分。此價量表是查閱文獻中做過類似模型的文章中記載的，分評價量表最早用在格拉斯昏迷評分量表(Glasgow Coma Scale， GCS)中，它是醫(yī)學上評估病人昏迷程度的方法，是由英國格拉斯哥大學的兩位神經(jīng)外科教授Graham Teasdale與Bryan J. Jennett在1974年發(fā)明的測評昏迷的方法。昏迷程度以三者分數(shù)相加來評估，得分值越高，提示意識狀態(tài)越好，比較客觀，現(xiàn)今分評價量表越來越多用在模型評價研究中。

1.3.6 肉眼觀察輸卵管形態(tài)

于實驗給藥28 d后，禁食不禁水12 h，用20%烏拉坦0.1 mL/kg腹腔麻醉，無菌條件下解剖大鼠，取雙側輸卵管，肉眼觀察輸卵管組織形態(tài)，并進行評分。

表1 各組實驗大鼠處理方法一覽表Table 1 List of the treatment methods for each group of experimental rats

表2 氣滯血瘀模型大鼠的癥候積分評價量表Table 2 Symptom score scale for evaluation of qi stagnation and blood stasis in the model

表3 肉眼觀察輸卵管組織形態(tài)學評分標準Table 3 Evaluation scores of gross appearance of the inducts

1.3.7 HE染色病理切片觀察

于實驗給藥21 d后，禁食不禁水12 h，用20%烏拉坦0.1 mL/kg腹腔麻醉，無菌條件下解剖大鼠，取雙側輸卵管，進行HE染色制成病理切片。

切取厚度為3 μm的大鼠輸卵管組織切片，放置于烤箱中2 h，溫度設定為65℃。使用二甲苯脫蠟，每次15 min，脫蠟兩次后進行脫水1 min，用蘇木素染色5 min，流水沖洗2～3 min， 1%鹽酸酒精分化2 s，溫水水沖15 min(返藍)，再用伊紅染色1 min，采用梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后在光鏡下觀察各組大鼠子宮組織形態(tài)學變化。

1.3.8 血流變學檢測

于給藥后21 d，禁食不禁水12 h，用20%烏拉坦0.1 mL/kg腹腔麻醉，無菌條件下腹主動脈取血測定血漿黏度、全血黏度3.0/s、30/s、50/s、100/s、180/s，還原黏度3.0/s、30/s、50/s、100/s、180/s，紅細胞剛性指數(shù)、聚集指數(shù)、電泳時間、變形指數(shù)，血沉方程K值。取肝素鈉抗凝血1 mL，3000 r/min離心10 min，吸取0.25 mL血漿，測定血漿黏度。取肝素鈉抗凝血1 mL，用血液粘度儀測定全血黏度。取400 μL抗凝血，用紅細胞變形聚集儀測紅細胞聚集指數(shù)。取20 μL抗凝血，加入15%PVP懸浮液1 mL中混勻，吸取50 μL用紅細胞變形聚集儀測紅細胞變形指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結果

2.1 大鼠體重和攝食量變化

除空白組(K)外，手術組(S)、模型組(M)、復合模型組(F)體重和飲食量均降低，其中復合模型組減低更為明顯(見表4、5)，從第2周起復合模型組大鼠開始出現(xiàn)對于刺激的不適應性，攝食量減少明顯。

表4 大鼠體重變化(g)Table 4 Weight changes in the rats

表5 大鼠攝食量變化(g)Table 5 Changes in food intake in the rats

2.2 一般行為學觀察結果

造成氣滯血瘀型慢性輸卵管炎的復合模型大鼠在活動量、精神、舌色、爪色、耳色等方面有很明顯的區(qū)別(見圖1、表6)，空白組大鼠以上行為學形態(tài)均正常，復合模型組活動量方面表現(xiàn)出行動遲緩，蜷縮少動，并伴有精神上萎靡，基本生活狀態(tài)不旺盛的現(xiàn)象；同時復合模型組的舌色發(fā)紫紅，爪色也與正常大鼠有明顯區(qū)別，顏色近乎于紫紅，耳色由白粉色色變?yōu)榧t色并帶有斑點出現(xiàn)，說明模型構建后大鼠表征狀態(tài)與一般行為學等各個方面均出現(xiàn)明顯差異。此外，模型組、復合模型組均在造模時出現(xiàn)1只死亡，對死亡大鼠進行解剖，考慮主要因急性感染導致死亡。

2.3 癥候積分評價結果

由表7可知，與空白組(K)比較，手術組(S)、模型組(M)、復合模型組(F)的癥候總積分顯著升高(P<0.01)；與模型組相比較，復合模型組癥候總積分亦有顯著上升(P<0.01)，提示氣滯血瘀加炎癥的復合模型構建成功，且與單獨注菌的炎癥模型組有明顯差異。

2.4 肉眼觀察輸卵管形態(tài)結果

由表8可知，與空白組(K)比較，復合模型組輸卵管80%出現(xiàn)嚴重血管腫脹，60%出現(xiàn)嚴重管壁增厚，50%出現(xiàn)嚴重盆腔粘連。

表6 大鼠一般行為狀況的觀察Table 6 Observation of general behavior in the rats

注：A:空白組大鼠舌色；B:復合模型組大鼠舌色；C:空白組大鼠耳色；D:復合模型組大鼠耳色；E:空白組爪色；F.復合模型組爪色。圖1 空白組(K)與復合模型組(F)大鼠舌色、耳色與爪色對比圖Note. A. Tongue, Blank group. B. Tongue, Compound model group. C. Ear, Blank group. D. Ear, Compound model group. E. Claw, Blank group. F . Claw, Compound model group. Figure 1 Comparison of the color of tongue, ear and claw between the rats of the blank group(K) and conpound model group(F)

2.5 病理學改變

由圖2可見，空白組輸卵管結構良好，粘膜清晰，無炎細胞浸潤、充血、水腫。手術組輸卵管周圍少量炎細胞，輸卵管結構尚完整。模型組輸卵管周圍組織淋巴細胞浸潤、疏松、水腫。復合模型組輸卵管管腔內(nèi)較多炎細胞浸潤，粘膜上皮細胞脫落，并伴有輸卵管周圍大量炎細胞浸潤，其中以淋巴細胞為主，部分區(qū)域疏松、水腫，輸卵管外膜血管擴張，充血，淋巴細胞浸潤。

2.6 血流變學檢測結果

2.6.1 對大鼠的血漿黏度、全血黏度在切變率3.0/s、30/s、50/s、100/s、180/s下的影響

由表9、10可知，與空白組比較，模型組的血漿黏度有顯著上升(P<0.05)，其全血黏度3.0/s與全血黏度30/s均有極顯著的上升(P<0.01)，復合模型組的血漿黏度、全血黏度3.0/s及30/s均有極顯著升高(P<0.01)，說明大鼠慢性輸卵管炎模型構建成功；與模型組比較，復合模型組血漿黏度、全血黏度3.0/s、全血黏度30/s升高極為顯著(P<0.01)，說明氣滯血瘀伴炎癥反應的復合模型與單獨注菌造成的炎癥模型有明顯差異。

表7 癥候總積分統(tǒng)計表Table 7 Symptom statistics

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。下表同。

Note. Compared with the blank group,△P< 0.05,△△P< 0.01.Compared with the model group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01. The same in the flowing tables.

表8 肉眼觀察輸卵管形態(tài)結果Table 8 Visual observation of the fallopian tube morphology

注：K.空白組；S.手術組；M.模型組；F.復合模型組。圖2 各組大鼠輸卵管HE染色圖(×100)Note. K. Blank group；S. Surgery group；M. Model group；F. Combined group.Figure 2 Histology of the rat fallopian tubes in the different groups (HE staining)

組別Groups血漿黏度Plasma viscocity全血黏度3.0/sBlood viscocity 3.0/s全血黏度30/sBlood viscocity 30/s空白組Blank group0.85±0.1119.97±2.208.06±1.18手術組Surgery group0.87±0.1222.64±2.359.49±1.24模型組Model group0.97±0.11△25.21±2.28△△10.61±1.48△△復合模型組Combined group1.39±0.19▲▲△△27.95±3.15▲▲△△13.86±1.76▲▲△△

2.6.2 對大鼠的還原黏度3.0/s、30/s、50/s、100/s、180/s的影響

由表11、12可知，與空白組比較，模型組、復合模型組的還原黏度3.0/s、還原黏度30/s有極顯著的上升(P<0.01)，模型組還原黏度50/s有顯著的上升趨勢(P<0.05)，復合模型組還原黏度50/s有極顯著的上升趨勢(P<0.01)，提示大鼠慢性輸卵管炎模型血流變學指標差異較為顯著；與模型組比較，復合模型組還原黏度3.0/s、還原黏度30/s、還原黏度50/s均顯著性增加(P<0.01)，提示氣滯血瘀加炎癥的復合模型與單獨注菌的炎癥有明顯差異，病證結合模型構建成功。

2.6.3 對大鼠的紅細胞剛性指數(shù)、聚集指數(shù)、電泳時間、變形指數(shù)，血沉方程K值的影響

由表13、14可知，與空白組比較，模型組中紅細胞剛性指數(shù)有顯著性升高(P<0.05)，紅細胞聚集指數(shù)有極為顯著的上升(P<0.01)；復合模型組的紅細胞剛性指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)有極顯著的增加(P<0.01)，提示大鼠慢性輸卵管炎模型構建成功；與模型組比較，復合模型組紅細胞剛性指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)有極顯著性升高(P<0.01)，有顯著性升高(P<0.05)，提示氣滯血瘀加炎癥的復合模型與單獨注菌造成的炎癥模型有明顯差異。

表10 對全血黏度在切變率50/s、100/s、180/s的影響Table 10 Effects on whole blood viscosity under shear rates 50/s, 100/s, and 180/s

表11 對還原黏度3.0/s、30/s、50/s的影響Table 11 Effect on reducing viscosity under shear rates 3.0/s, 30/s, and 50/s

表12 對還原黏度100/s、180/s比較表Table 12 Comparison for reduced viscosity under shear rates 100/s and 180/s

表13 對紅細胞剛性指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)的影響Table 13 Influence on the red cell rigidity index and erythrocyte aggregation index

表14 對血沉方程K值，紅細胞電泳時間、變形指數(shù)的影響Table 14 Effect of K value on erythrocyte sedimentation rate, erythrocyte electrophoresis time, and deformation index

3 討論

慢性輸卵管炎是導致輸卵管性不孕癥和異位妊娠的重要原因，嚴重影響女性的生殖健康。目前西醫(yī)治療方法主要為抗生素，在慢性期和后遺癥期效果不佳，中藥在慢性轉歸方面療效顯著，具有活血、化瘀、止痛、抗菌、消炎、提高免疫力、改善微循環(huán)的作用，有利于局部炎癥的瘢痕軟化、松解，微循環(huán)的改善。然而慢性輸卵管炎容易反復發(fā)作，需要長期按療程治療，為了更好地研究輸卵管炎的發(fā)病機制和尋找更有效的治療方法，建立最接近人類發(fā)病的理想動物模型，是不可或缺的堅實基礎。

病證結合模型是中西醫(yī)相結合的連接橋梁[4-7]，現(xiàn)代的病證結合模型，多數(shù)為西醫(yī)的病加中醫(yī)的證，這種病證結合模型的優(yōu)勢在于既有西醫(yī)中明確的病理組織、器官、血液的評價支持，又引入中醫(yī)的辨證思想，可以動態(tài)觀察宏觀指標和微觀指標，這更符合臨床診治的情況，先辨病，再辨證，辨證論治，更有利于探討疾病的病理變化在中醫(yī)特定證型中的表現(xiàn)。

目前建立符合氣滯血瘀型慢性輸卵管炎的病證結合模型是非常困難的，本實驗在預實驗中也進行了長期的摸索，最終確定了現(xiàn)行病證結合模型。在氣滯血瘀模型方面經(jīng)過反復的預實驗，選擇了與人類發(fā)病機理最類似的方法進行模型構建，在炎癥模型方面摸索了不同的菌種，菌濃度，接種方法，接種劑量。在保證模型成功同時，兼顧大鼠的帶病生存，以備實驗用。并且通過實驗觀察，研究人員發(fā)現(xiàn)在整個過程中，復合模型組大鼠(病證結合模型大鼠)從行為學的一般特征和癥候總積分都符合氣滯血瘀模型的改變，與模型組大鼠(單純慢性輸卵管炎癥模型)存在顯著的差異，說明病證結合模型的結果和單純慢性輸卵炎模型的結果是存在差異的。對氣滯血瘀型模型大鼠的血流變學指標進行檢測，發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀型慢性輸卵管炎模型大鼠與慢性輸卵管炎模型大鼠在血液粘度、還原粘度、紅細胞剛性指數(shù)、聚集指數(shù)等方面存在差異性，這也為相關人員對中醫(yī)藥的進一步研究提供了新思路，更加證明了病證結合模型大鼠建立的意義。實驗結果可知，復合模型組大鼠存在氣滯血瘀的改變，具有慢性輸卵管炎癥的表現(xiàn)，從而印證了病證模型的成功。

現(xiàn)代醫(yī)學常將中醫(yī)瘀證解釋為機體的心血管在特定的內(nèi)因和外因共同的作用下[8]，導致的一系列生理、病理改變，從而影響血液流變，表現(xiàn)為血液流動緩慢，嚴重者可導致阻滯，由動態(tài)，變成為靜態(tài)，血液循環(huán)障礙和受累的組織，發(fā)生炎癥、水腫、腐爛、壞死、增生等一系列變化。血瘀證包括一系列的生理、病理改變，與微循環(huán)、血液循環(huán)密切相關，與炎癥反應、代謝障礙、免疫功能、組織增生都有一定關系[9-12]。因此常用血流變學檢測指標對血瘀程度進行評估。而炎癥是機體對損傷的一種反應，包括血液和結締組織的變化、微循環(huán)的障礙等。機體受到致炎因子的刺激后，會引起一系列的變化，以助于清除有害物質(zhì)、修復受損組織。表現(xiàn)為血管通透性增加、白細胞游走和增值期等，這些變化會導致血流變學指標出現(xiàn)相應的改變。

本實驗研究中，從宏觀到微觀多層次選擇觀察指標，從癥候評分、病因病機變化以及血液流變學指標改變來多角度界定，成功建立了大鼠氣滯血瘀型慢性輸卵管炎模型，并以臨床中西醫(yī)結合理論為基礎，通過聲、光、電、夾尾刺激造成大鼠氣滯血瘀，客觀分析該模型的可行性，并用于模型的系統(tǒng)評價，造模方法可行，成功率較高，較符合常見氣滯血瘀型慢性輸卵管炎的病癥臨床表現(xiàn)，為進一步實驗研究提供堅實基礎。