劉自然，霍東升，賈建新，楊占君

(包頭醫(yī)學(xué)院解剖教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014000)

現(xiàn)代生活中，腦血管疾病具有高發(fā)病率，高致殘率，高死亡率的特點，嚴重危害人類的健康[1]。急性缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵是早期疏通阻塞血管， 目前證實的有效治療是靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑溶栓[2]。但該治療方法僅僅對于那些缺血時間在6 h內(nèi)的病人有效，治療獲益有時間依賴性，其治療效果仍有較大的提升空間[3]。腦缺血區(qū)再灌注血流會引起腦組織細胞的損傷和功能障礙，因此，防治腦缺血再灌注損傷就顯得極為重要。

羅丹寧衍生物具有廣泛的藥理活性。通過對雜環(huán)的修飾，可有抗凋亡，抗菌，抗病毒，抗炎，抗氧化等作用[4]。前期課題組已證實，5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧(RD-1)具有良好的抗帕金森病作用[5]。本研究通過線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型，對模型大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評分用Longa5分法，檢測腦梗死體積用TTC染色法，檢測SOD，GSH-Px活性，MDA含量，以及Bcl-2，Bax，caspase-3蛋白的表達水平，以探討羅丹寧對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠(240～260 g)144只，購于河北醫(yī)科大學(xué)解剖教研室，生產(chǎn)許可證號[SCXK(冀)2016-1-003]，使用許可證號[SYXK(冀)2016-24]，合格證號：1202176。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(包院字20181120)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

RD-1(北京友誼眾生生物科技有限公司)，尼莫地平(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，每片60 mg，批號170401)，TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)(Sigma公司，美國，批號T8160)，超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所，批號A001)，谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)(南京建成生物工程研究所，批號A005)，丙二醛(MDA)(南京建成生物工程研究所，批號A003)，Bcl-2抗體(碧云天生物科技有限公司，批號AA112-2)，Bax抗體(碧云天生物科技有限公司，批號AB026-2)，Caspase-3抗體(碧云天生物科技有限公司，批號AC030-2)，β-actin抗體(碧云天生物科技有限公司，批號AA128-2)，兔抗鼠IgG(北京諾博萊德科技有限公司，批號NRPA24-10)。

TDL-40B型離心機(上海安亨科學(xué)儀器廠)，Max-M5型酶標儀(美國Molecular Devices公司)，恒溫水浴鍋(天津泰斯特凈化設(shè)備有限公司)，分光光度計(美國Beckman Coulter公司)，Mini Protean 3 cell電泳儀(電泳)(美國Bio-Rad公司)，DYCZ-24DN電泳系統(tǒng)(轉(zhuǎn)膜)(上海醫(yī)療儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備、實驗分組及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，術(shù)前12 h禁食,不禁水,參照Longa法[6]制成大鼠大腦中動脈缺血模型。大鼠麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部剪毛,碘伏消毒,右側(cè)頸部旁正中線一做縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織和頸闊肌,分離右側(cè)頸總動脈，以及頸內(nèi)動脈，及頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端，從頸外動脈或頸總動脈插入栓線，經(jīng)頸內(nèi)動脈進入大腦中動脈，栓線插入深度約為20 mm。缺血2 h后，輕輕提拉所留線頭至略有阻力，實現(xiàn)大腦中動脈再灌注，造模完成。

大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型制作成功后，隨機分為5組，假手術(shù)組(Sham group)為1組，共6組，每組6只。分別為：模型組(MCAO group)：灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液；陽性對照組：灌胃給予尼莫地平(Nimodipine)(10 mg/kg)；RD-1低劑量組(RD-1-L group)：灌胃給予RD-1 5 mg/kg；RD-1中劑量組(RD-1-M)：灌胃給予RD-1 10 mg/kg；RD-1高劑量組(RD-1-H group)：灌胃給予RD-1 20 mg/kg；假手術(shù)組(Sham)：灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。各組大鼠連續(xù)給藥14 d。

1.3.2 神經(jīng)行為學(xué)評分及腦梗死體積測定

恢復(fù)血液再灌注24小時以后，參照Longa 5級4分制評分原則：①0分，正常，無神經(jīng)系統(tǒng)異常的體征。②1分，不能完全伸展病變對側(cè)上肢。③2分，行走時向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)。④3分，行走時向?qū)?cè)傾倒。⑤4分，無自發(fā)活動伴意識降低。得1～4分者為成功模型。術(shù)中意外死亡、再灌注24 h內(nèi)死亡、蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠被剔除并隨機補充。

模型成功的大鼠斷頭取腦，置于-20℃冰箱冰凍約10 min，然后將腦組織間隔2 mm冠狀切5刀，切成6個大腦連續(xù)的冠狀切面。然后將大腦切片置于5 mL含1%TTC的PBS溶液中，在37℃恒溫箱內(nèi)避光孵育，約30 min，間隔10 min將大腦切片翻動一次。取出腦片放入4%多聚甲酵中固定后拍照保存，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統(tǒng)計，計算每張腦片的梗死面積并根據(jù)腦片厚度計算相對梗死體積。

1.3.3 腦組織氧化因子檢測

取各組大鼠大腦缺血側(cè)大腦皮層組織，以 1 g∶9 mL 的比例加入冰生理鹽水，制成 10%的腦勻漿液。置于 4℃離心機 2500 r/min 離心 15 min，取上清液。按各個試劑盒說明書中的操作說明進行檢測腦組織SOD，GSH-Px活性及MDA含量。

1.3.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測相關(guān)凋亡蛋白的表達

取大鼠腦組織加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液，低溫下制備腦組織勻漿，4℃離心后取上清，用BCA法測總蛋白濃度，以20 μg總蛋白上樣，10%分離膠電泳后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉，漂洗等步驟后，一抗Bcl-2(1∶1000)、Bax(1∶1000)、caspase-3(1∶1000)室溫孵育2 h，辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，曝光拍照，利用Image J進行圖像灰度值處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 羅丹寧對大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及腦梗死體積比的影響

術(shù)后對各組大鼠用藥后1、3、7和14 d進行評分。初時(1～3 d)明顯觀察到術(shù)后模型成功的大鼠有健側(cè)前肢屈曲和肢體肌無力，自由運動時不能直線行走，向健側(cè)轉(zhuǎn)圈，嚴重者會向患側(cè)傾倒。假手術(shù)大鼠未顯示出神經(jīng)損傷的跡象。 隨著時間的延長，各組大鼠均恢復(fù)，但與假手術(shù)組比較，模型組術(shù)后各時段神經(jīng)功能缺損評分仍顯著增高，且損傷較重。(P<0.05)。各給藥組大鼠與模型組大鼠評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 第14天，RD-1低、中、高劑量組大鼠的評分顯著低于模型組(P<0.05)，陽性藥物尼莫地平也對模型組神經(jīng)損傷的恢復(fù)作用有顯著影響。(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組腦梗死體積明顯增加(P<0.05)。 與模型組比較，經(jīng)RD-1治療14天后，腦梗死體積明顯減小，缺血性損傷得到緩解。通過對MCAO模型大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死體積測定的綜合判斷，發(fā)現(xiàn)持續(xù)給予RD-1 14 d可顯著改善腦缺血再灌注損傷，減少神經(jīng)功能缺損評分，減少腦梗死體積，起到很好的神經(jīng)保護作用。(圖1、圖2)

2.2 RD-1對大鼠腦組織抗氧化作用大的影響

模型組腦組織中SOD和GSH-PX活性降低，MDA含量升高。 與假手術(shù)組比較，有顯著性差異(P<0.05),與模型組比較,除腦組織GSH-Px含量RD-1中劑量組無顯著性變化外(P>0.05), 其它各組大鼠腦組織中SOD和GSH-PX活性均顯著升高，但MDA含量明顯降低(P<0.05)，提示RD-1可降低大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平。(圖3)

注：圖中四組bar依次代表各組大鼠用藥后1、3、7和14 d評分情況，與假手術(shù)組組比較，*P <0.05，與模型組組比較，#P <0.05。圖1 RD-1對MCAO模型大鼠神經(jīng)功能評分的影響Note. The four groups of bars in the figure represent the scores of rats in each group at 1, 3, 7 and 14 days after treatment. Compared with Sham group, *P<0.05. Compared with MCAO group, #P<0.05.Figure 1 Effect of RD-1 on neurological function scores in MCAO model rats

注：A：假手術(shù)組,B：模型組,C：低劑量組,D：中劑量組,E：高劑量組,F：尼莫地平組。與假手術(shù)組比較，*P <0.05。與模型組比較，#P <0.05。圖2 RD-1對MCAO模型大鼠腦梗死體積比的影響Note. A：Sham group,B：MCAO group,C：RD-1-L group,D：RD-1-M group,E：RD-1-H,F：Nimodipine group. Compared with Sham group,*P <0.05.Compared with MCAO group，#P <0.05.Figure 2 Effect of RD-1 on the volume ratio of cerebral infarction in MCAO model rats

注：A：假手術(shù)組,B：模型組,C：低劑量組,D：中劑量組,E：高劑量組,F：尼莫地平組。與假手術(shù)組組比較，*P <0.05。與模型組組比較，#P <0.05。圖3 RD-1對MCAO模型大鼠腦組織抗氧化作用的影響Note. A：Sham group,B：MCAO group,C：RD-1-L group,D：RD-1-M group,E：RD-1-H,F：Nimodipine group.Compared with Sham group,*P <0.05.Compared with MCAO group，#P <0.05.Figure 3 Effect of RD-1 on the antioxidation in brain tissue in MCAO model rats

2.3 RD-1對大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，MCAO組Bcl-2表達顯著降低，Bax和caspase-3表達顯著增高(P<0.05)。 與MCAO組相比，尼莫地平組和RD-1低，中，高劑量組Bcl-2水平顯著升高，Bax和caspase-3水平顯著降低(P<0.05)，提示RD-1可通過影響細胞中Bcl-2，Bax和caspase-3的水平影響細胞凋亡。進而達到腦缺血再灌注后神經(jīng)元保護的目的。

3 討論

在本研究中，通過線栓建立大鼠大腦中動脈閉塞模型，并在缺血2 h后再灌注。連續(xù)給藥14 d后，進行一系列行為學(xué)測試和梗塞體積計算以評估RD-1抗腦缺血再灌注損傷作用的藥效學(xué)效應(yīng)。建立腦缺血再灌注損傷動物模型是進行缺血性腦病實驗的基礎(chǔ)，栓線制備大鼠腦缺血再灌注模型[7]。因其損傷小，操作簡便，缺血部位恒定，可準確控制缺血和再灌注時間等特點得到國內(nèi)外廣泛的應(yīng)用[8-13],評分從功能角度反映腦缺血的病理損傷，梗死體積評價了腦缺血造成的組織損傷，目前應(yīng)用較多的大鼠神經(jīng)損傷嚴重程度評分標準可以對大鼠進行全面綜合的評價，分數(shù)越高表明損傷越嚴重。與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)評分和腦梗死體積明顯增加。RD-1藥物組與模型組相比，神經(jīng)評分和腦梗死體積明顯減少，提示RD-1能改善模型大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，降低腦梗死體積比。表明RD-1對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

注：A：假手術(shù)組,B：模型組,C：低劑量組,D：中劑量組,E：高劑量組,F：尼莫地平組。與假手術(shù)組組比較，*P <0.05。與模型組組比較，#P <0.05。圖4 RD-1對MCAO模型大鼠神經(jīng)元細胞凋亡的影響(±s,n=6)Note. A：Sham group，B：MCAO group，C：RD-1-L group，D：RD-1-M group，E：RD-1-H，F(xiàn)：Nimodipine group.Compared with Sham group,*P <0.05.Compared with MCAO group，#P <0.05.Figure 4 Effect of RD-1 on neuronal apoptosis in MCAO model rats

腦缺血再灌注可產(chǎn)生大量的氧自由基。 神經(jīng)組織本身缺乏抗氧化物質(zhì)，富含對氧自由基敏感的多不飽和脂肪酸。 因此，腦細胞最容易受到氧自由基的攻擊[14]。SOD廣泛存在于各種生物體中，是清除氧自由基中最重要的抗氧化酶; GSH-Px催化過氧化氫分解形成水和氧化的GSH，為維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能，從而防止細胞氧化損傷。 MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可間接反映細胞受到自由基攻擊的嚴重程度[15]。本研究中，RD-1各劑量組大鼠腦組織SOD和GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著降低，說明RD-1具有降低氧化應(yīng)激水平的作用。

腦缺血再灌注損傷過程中，神經(jīng)細胞以凋亡為主要死亡方式，Bcl-2家族發(fā)揮了極為關(guān)鍵的調(diào)控作用，可以減低凋亡水平，相反，促凋亡蛋白Bax通過破壞線粒體膜的完整性，并激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax和caspase-3蛋白表達明顯升高，RD-1給藥后，各個劑量組均能明顯降低Bax和caspase-3蛋白表達水平，并升高Bcl-2蛋白的表達，提示RD-1有抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。

綜上所述，5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧(RD-1)對腦缺血再灌注損傷具有良好的神經(jīng)保護作用，其作用機制涉及減輕線粒體損傷，清除氧自由基，抑制神經(jīng)元凋亡；抑制細胞外鈣離子內(nèi)流和細胞內(nèi)鈣離子釋放來防止細胞內(nèi)鈣離子超載所致的平滑肌收縮作用，降低興奮性氨基酸毒性作用[17]；抑制神經(jīng)元興奮性，降低能量的消耗，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。從而達到改善受損動物的神經(jīng)功能障礙。