陳姣姣，陳小真，郁 晨，徐松濤，施佳君，馬全鑫，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是嚴(yán)重危害人民健康的常見病、多發(fā)病之一[1]，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病代謝異常引起的腎小球硬化癥，是DM常見的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭最重要的原因之一，亦是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要因素[2]。目前對(duì)DN 尚無特效的治療方法，但中醫(yī)藥在控制 DN 癥狀及延緩病情發(fā)展方面有著極其重要的作用。

丹酚酸A(SAA)是丹參有效水溶性成分之一，具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等[3-4]。目前已有多項(xiàng)研究表明SAA對(duì)糖尿病腎病有顯著的改善作用[5-9]。糖脂代謝紊亂、炎癥、氧化應(yīng)激等多種危險(xiǎn)因素促進(jìn)DN發(fā)生與惡化，近年來，有研究發(fā)現(xiàn)脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)，是預(yù)測(cè)心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)指標(biāo)，也可反應(yīng)腎臟損傷和動(dòng)脈硬化的進(jìn)展[10]。Lp-PLA2可通過促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，阻斷胰島素受體信號(hào)的負(fù)反饋回路，加速DN發(fā)生與發(fā)展[11]；而抑制Lp-PLA2可降低微血管通透性，改善糖尿病微血管病變[12]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，SAA可減緩和改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的同時(shí)，可顯著降低糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠血清中Lp-PLA2的活性[13]。視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病均為糖尿病微血管并發(fā)癥，故而推測(cè)SAA改善糖尿病腎病的作用機(jī)制可能與降低Lp-PLA2水平相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)自發(fā)性糖尿病大鼠Zucker Diabetes Fatty(ZDF)大鼠作為早期糖尿病腎病模型，觀察SAA對(duì)ZDF大鼠腎臟的保護(hù)作用以及對(duì)Lp-PLA2的調(diào)節(jié)作用，為SAA的開發(fā)應(yīng)用研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)7～8周齡雄性ZDF大鼠40只(體重200±10 g)及同周齡的雄性瘦型ZL大鼠8只(體重170±10 g)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2012-001]；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障實(shí)驗(yàn)室[SYXK(浙)2013-184]，環(huán)境溫度：(22±2)℃，相對(duì)濕度：50%～60%，光照：12 h/12 h明暗交替，噪聲<50 dB；在IVC籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲食。經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)通過，決議編號(hào): ZSLL-2015-72。

1.2 主要試劑與儀器

丹酚酸A粉針劑，由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供；Lp-PLA2抑制劑：darapladib，由中國(guó)科學(xué)院上海藥物所提供。BUN、Crea試劑盒購(gòu)自上海申能-德賽診斷技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)(ELISA)試劑盒：TRF、mALB、RBP購(gòu)自杭州誠(chéng)維生物有限公司；Lp-PLA2活性檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Abcam公司；PAS染色試劑盒，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit)和熒光定量試劑盒(SYBR Premix TaqTM Ⅱ)，購(gòu)自日本TaKaRa公司；Lp-PLA2抗體、羊抗(二抗)，購(gòu)自Abcam公司。

全自動(dòng)生化分析儀(7020，日立公司，日本)；Thermo多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash Thermo公司，美國(guó))；Nana Zoomer數(shù)字切片掃描設(shè)備(2.0 RS，濱松公司，日本)；半自動(dòng)石蠟切片機(jī)(RM2245，Leica公司，德國(guó))；自動(dòng)染色機(jī)(Autostainer XL，Leica公司，德國(guó))；激光多普勒血流儀(ML191，埃德儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司，澳大利亞)；RT-PCR儀(iQ5型，Bio-Rad公司，美國(guó))；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(CLx，Odyssey公司，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與給藥

取7～8周齡雄性ZDF大鼠40只，飼喂Purina#5008飼料，飼養(yǎng)4周后，根據(jù)體重與血糖值，分為5組，即模型對(duì)照組，SAA 0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只。另取8只同周齡ZL大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，作為正常對(duì)照組。參考馬全鑫等[12]的研究設(shè)置SAA各劑量組ZDF大鼠每日分別尾靜脈注射SAA 0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠每天經(jīng)口灌服25 mg/kg darapladib，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組每日一次經(jīng)口灌服5 mL/kg生理鹽水，連續(xù)給藥12周。

1.3.2 腎功能與腎微循環(huán)血液流變學(xué)的變化

給藥12周后，用大鼠代謝籠法收集24 h尿液，檢測(cè)TRF、mALB、RBP的含量，另外，各組大鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈取血0.5 mL，分離血清，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)Bun、Crea的含量。隨后，各組大鼠經(jīng)3%～4%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后，將其仰臥位固定于鼠板上，并用1%～2%異氟烷維持麻醉，按外科手術(shù)方法打開腹腔，用激光多普勒血流儀檢測(cè)雙腎表面血流速度。

1.3.3 腎臟組織病理學(xué)觀察

所有大鼠進(jìn)行CO2安樂死后，取腎臟，甲醛固定，脫水，包埋切片，分別行蘇木素-伊紅(HE)染色與PAS染色，觀察腎臟組織病理變化。

1.3.4 Lp-PLA2活性測(cè)定

給藥前及給藥4、8、12周時(shí)，大鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈取血0.5 mL，分離血清，使用ELISA試劑盒檢測(cè)Lp-PLA2活性。

1.3.5 腎組織中Lp-PLA2基因和蛋白的表達(dá)

取部分腎組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)Lp-PLA2引物(GAPDH: F:5’-GGCACAGTCAA GGCTGAGAATG-3’，R:5’-ATGGTGGTGAAGACG CCAGTA-3’，Lp-PLA2: F:5’-CTGACGGGACTTTT GTAACTGG-3’，R:5’-AGCCTTGTTGGTGAGGTC TATG-3’)，使用RT-PCR儀將cDNA進(jìn)行二步法擴(kuò)增，所有反應(yīng)信息資料由Bio-Rad iQ5 PCR儀收集。GAPDH基因作為內(nèi)參對(duì)照，目的基因轉(zhuǎn)錄水平通過公式2-△△CT計(jì)算腎組織中Lp-PLA2 mRNA表達(dá)量。

同時(shí)，稱取20 mg腎臟，加入裂解液進(jìn)行勻漿處理，高速離心10 min，取上清至預(yù)冷的1.5 mL離心管中；按照 5∶1 的比例加入變性劑，在加熱器上，加熱5 min；按蛋白含量上樣，濃縮膠恒壓80 V(20 min)，分離膠恒壓 200 V，待溴酚藍(lán)移至分離膠底部時(shí)，終止電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至 NC 膜上，電轉(zhuǎn)200 mA，90 min，BSA封閉2 h，孵育一抗(1∶10000)過夜、孵育二抗(1∶10000)1 h，將NC膜放至Odyssey紅外熒光掃描儀上進(jìn)行掃描，分析蛋白條帶，計(jì)算灰度值來反映腎組織中Lp-PLA2蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SAA對(duì)ZDF大鼠腎微循環(huán)血流及腎功能的影響

與正常對(duì)照組比，模型對(duì)照組腎微循環(huán)血流速度變慢(P<0.01)，與模型對(duì)照組比，給予0.5 mg/kg、1 mg/kg的SAA以及25 mg/kg darapladib后，均可顯著提高微循環(huán)血流速度(P<0.05，P<0.01)。另外，模型對(duì)照組血清BUN明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，除0.25 mg/kg的SAA外，其余各給藥組的BUN水平均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，但給藥組Crea水平均無明顯影響(P>0.05)，見圖1。

2.2 SAA對(duì)ZDF大鼠尿中TRF、mALB、RBP的影響

模型對(duì)照組ZDF大鼠尿TRF、mALB、RBP水平均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)；與模型對(duì)照組比，0.5 mg/kg SAA組能顯著降低尿TRF水平(P<0.05)，1 mg/kg SAA組能顯著降低尿TRF、mALB、RBP水平(P<0.01)，darapladib組亦能顯著降低TRF和RBP水平(P<0.05,P<0.01)，見圖2。

注:A為微循環(huán)血流速度，B為尿素氮水平，C為肌酐水平。與正常對(duì)照組比，*P<0.05,**P<0.01。與模型對(duì)照組比，#P<0.05,##P<0.01。圖1 SAA對(duì)ZDF大鼠腎微循環(huán)血流及腎功能的影響Note. A: Microcirculation blood flow velocity, B: BUN level, C: Crea level; Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01. Compared with model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 1 Effects of SAA on renal microcirculation blood flow and function in the ZDF rats

2.3 SAA對(duì)腎臟組織病理的影響

HE染色顯示，正常對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)完整，系膜區(qū)未見異常，無明顯病理變化；模型對(duì)照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)紊亂，系膜細(xì)胞明顯增生、分布彌散，炎性浸潤(rùn)，可見顯著性病變；各給藥組腎臟組織病理有所改善，見圖3-1；另外，PAS染色顯示，正常對(duì)照組糖原沉積較少，著色較淡，結(jié)構(gòu)完整，基底膜與系膜區(qū)無明顯病變；模型對(duì)照組大鼠糖原沉積明顯，著色較深，結(jié)構(gòu)不清，腎小球系膜區(qū)增大，腎小管基膜增厚；各給藥組大鼠結(jié)構(gòu)明顯改善，病變減輕，見圖3-2。

注：a:正常對(duì)照組，b:模型對(duì)照組，c-e分別為0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg SAA組，f:Darapladib組。圖3-1 SAA對(duì)ZDF大鼠腎臟組織病理學(xué)的影響(HE染色， ×400)Note. a: Control group, b: Model group, c-e:0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg SAA group, f: Darapladib group.Figure 3-1 Effects of SAA on renal pathology in the ZDF rats(HE staining)

注：a:正常對(duì)照組，b:模型對(duì)照組，c-e分別為0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg SAA組，f:Darapladib組。圖3-2 SAA對(duì)ZDF大鼠腎臟組織病理學(xué)的影響(PAS染色, ×400)Note. a: Control group, b: Model group, c-e:0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg SAA group, f: Darapladib group.Figure 3-2 Effects of SAA on renal pathology in the ZDF rats(PAS staining)

2.4 SAA對(duì)ZDF大鼠血清Lp-PLA2活性的影響

與正常對(duì)照組比，模型對(duì)照組 Lp-PLA2活性在給藥前及給藥后4、8、12周時(shí)顯著升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比，給予0.5 mg/kg和1 mg/kg SAA組和darapladib組 Lp-PLA2活性顯著降低(P<0.05，P<0.01)，見表1。

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組ZDF大鼠腎組織Lp-PLA2 mRNA與蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比，各給藥組ZDF大鼠腎組織Lp-PLA2 mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，同時(shí)，0.5 mg/kg和1 mg/kg SAA組和darapladib組均能顯著降低ZDF大鼠腎組織Lp-PLA2蛋白表達(dá)(P<0.01)，見圖4。

3 討論

ZDF大鼠是從出現(xiàn)糖尿病表型的Zucker 大鼠中篩選出來的，是一種自發(fā)性2型糖尿病大鼠，具有胰島素抵抗，脂質(zhì)紊亂、糖耐量異常等特征，在16周齡時(shí)可出現(xiàn)早期微血管并發(fā)癥，包括早期腎病、視網(wǎng)膜病變、心肌病變較為突出，腦神經(jīng)元輕微病變[14]，在其20周齡時(shí)蛋白排泄和濾過異常，腎功能減退，逐步發(fā)展成為DN[15]。DN的臨床癥狀主要有水腫、高血壓、持續(xù)性蛋白尿，腎臟微循環(huán)血流障礙及尿生化指標(biāo)異常[16-17]。本實(shí)驗(yàn)以Zucker 瘦型大鼠ZL 作為正常對(duì)照組，研究發(fā)現(xiàn)ZDF大鼠23-24周時(shí)也出現(xiàn)腎微循環(huán)血流速度顯著下降，尿mALB，TRF和RBP等尿生化指標(biāo)異常升高，腎小球基底膜增厚、糖原積累等病理學(xué)改變，與DN臨床表現(xiàn)一致，表明ZDF大鼠DN模型成立。給予SAA的ZDF大鼠腎臟微循環(huán)血流速度增高、尿生化指標(biāo)水平得到改善，腎小球和腎小管糖原沉積減少，系膜區(qū)與基底膜增生、增厚情況均明顯減輕，與Hou等研究結(jié)果一致[8]，提示SAA對(duì)DN具一定的保護(hù)作用。

mALB、TRF、RBP是診斷早期DN的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子[18]，這些尿蛋白指標(biāo)增高是腎臟發(fā)生腎小管損害、腎小球?yàn)V過障礙、血管內(nèi)皮功能下降的有力證據(jù)，可被視為DN嚴(yán)重程度的量度。給予SAA后能明顯降低尿TRF、mALB和RBP水平，且呈一定的劑量依賴性；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)SAA干預(yù)后能顯著降低血清中BUN水平，但對(duì)Crea無明顯影響，這可能與本研究中的ZDF大鼠模型還處于DN早期階段，以尿蛋白代謝紊亂為主，表明SAA對(duì)ZDF大鼠早期DN的蛋白代謝紊亂具有明顯的改善作用；另外也發(fā)現(xiàn)給予darapladib后并未直接降低尿mALB水平，但可抑制尿TRF、RBP水平，提示darapladib可能通過抗炎作用[19]，間接降低BUN，從而改善蛋白代謝紊亂，其機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

表1 SAA對(duì)ZDF大鼠血清Lp-PLA2活性的影響Table 1 Effects of SAA on serum Lp-PLA2 activity in the ZDF rats

注:與正常對(duì)照組比，*P<0.05,**P<0.01;與模型對(duì)照組比，#P<0.05,##P<0.01。。

Note. Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01, Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01.

注:A為L(zhǎng)p-PLA2 mRNA表達(dá)量，B為L(zhǎng)p-PLA2蛋白表達(dá)量；圖B中a為正常對(duì)照組，b為模型對(duì)照組，c-e分別為0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg SAA組，f為Darapladib組；與正常對(duì)照組比，*P<0.05,**P<0.01；與模型對(duì)照組比，#P<0.05，##P<0.01。圖4 SAA對(duì)ZDF大鼠腎組織Lp-PLA2表達(dá)的影響Note. A: Lp-PLA2 mRNA expression, B: Lp-PLA2 protein expression; In Fig. B, a: Normal group, b: Model group, c-e:0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg SAA group, f:Darapladib group. Compared with control group, *P<0.05,**P<0.01.Compared with model group, #P<0.05,##P<0.01.Figure 4 Effects of SAA on the renal mRNA and protein expression of Lp-PLA2 in the ZDF rats

Lp-PLA2是一種炎癥性疾病的新型標(biāo)記物，可水解氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)中的氧化磷脂，生成溶血磷脂膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)和氧化游離脂肪酸(oxidized free fatty acid, OX-NEFA)[20-21]，二者具有促氧化、促炎等作用，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)血管通透性障礙。苗艷等[22]對(duì)240名DN患者血清Lp-PLA2活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與尿微量白蛋白含量及DN嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在本研究中ZDF大鼠DN模型中的血清Lp-PLA2活性上升，腎臟Lp-PLA2的基因和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，證實(shí)了Lp-PLA2的活性和在腎臟中表達(dá)水平與DN的嚴(yán)重程度有關(guān)。有研究表明給予Lp-PLA2抑制劑可通過降低空腹血糖和胰島素水平改善胰島素敏感性，從而在一定程度上修復(fù)糖尿病妊娠大鼠的代謝異常[23]。同樣本研究中Lp-PLA2抑制劑(darapladib)干預(yù)ZDF大鼠后亦能在一定程度上改善DN狀態(tài)；且0.5 mg/kg、1 mg/kg SAA能明顯抑制ZDF大鼠血清中Lp-PLA2的活性及其在腎臟組織中的表達(dá)，這也證實(shí)了SAA具有抗炎作用，與Fan等報(bào)道一致[24]。由此提示，SAA可能是通過抑制Lp-PLA2的活性，降低機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)；同時(shí)通過抑制Lp-PLA2在腎臟中的表達(dá)，改善腎小球血管通透性和腎組織局部的炎癥微環(huán)境，從而起到保護(hù)ZDF大鼠腎臟的作用。

綜上所述，SAA可改善2型糖尿病大鼠腎微循環(huán)和尿蛋白代謝紊亂，改善腎組織炎癥，減緩DN的發(fā)展，其機(jī)制可能與抑制血清Lp-PLA2活性和抑制腎組織中Lp-PLA2的表達(dá)有關(guān)。