劉 敏，許棟明，孫芳玲，劉婷婷，李艷菲，王 文*

(1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053；3.科學(xué)技術(shù)部火炬高技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)中心，北京 100045)

缺血性腦卒中在臨床上具有“三高”—高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，一直是臨床研究的重點(diǎn)。有研究表明，腦梗死灶周圍新生血管密度與患者存活率密切相關(guān)，且腦血管的生成可以為神經(jīng)元重塑提供關(guān)鍵的神經(jīng)血管基質(zhì)，從而提升動物和患者的神經(jīng)功能[1-3]。在動物大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型中，研究學(xué)者證實腦缺血24 h后梗死周邊內(nèi)皮細(xì)胞開始增殖[4]，第3天新生血管密度增殖達(dá)到最大，之后減少，但這個過程短暫而微弱，不足以使梗死周邊血流恢復(fù)。在血管新生的過程中，一系列促血管生長因子參與調(diào)節(jié)，這些因子在腦損傷后一定時間內(nèi)可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，通過外源性藥物，促進(jìn)內(nèi)源性血管生長因子的表達(dá)，增加血管新生，改善神經(jīng)功能是目前缺血性腦卒中的有效治療方法。

莫諾苷(morroniside)是從中藥山茱萸中篩選出的一種有效成分。本課題組前期研究表明，其具有抗氧化[5- 6]、抗凋亡[7]、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖[8]的作用。此外，前期研究結(jié)果表明[9-13]，在大鼠局灶性腦缺血再灌注3 h后給予莫諾苷，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管新生、增加血管密度，腦血流量，起到神經(jīng)保護(hù)作用。但臨床上發(fā)生腦卒中的患者，3 h內(nèi)大多不能得到及時治療。因此，進(jìn)一步研究藥物的擴(kuò)大治療時間窗具有重要的意義。本研究初步探索在大鼠局灶性腦缺血再灌注后24 h給予莫諾苷的治療效果，進(jìn)一步研究其擴(kuò)大有效治療時間窗，為臨床研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠50只，體重260～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(京)2016-0006]，使用許可證號：[SYXK(京)2015-0016]。12 h晝夜循環(huán)，飼養(yǎng)溫度23℃±2℃，濕度60%±5%。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，術(shù)后參照Zea Longa[14]評分法，剔除得分為1分和5分的SD大鼠。剩余大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組， 模型組， 莫諾苷小(30 mg/kg)、 中(90 mg/kg、)、大(270 mg/kg)劑量組，每組各10只，術(shù)后24 h開始給予莫諾苷，每天灌胃1次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水。動物實驗過程遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

莫諾苷由本科室從山茱萸中提取制備，淡黃色粉末，高效液相色譜法分析其純度大于95%。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)：北京化學(xué)試劑公司。BCA試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司。RIPA 裂解液(強(qiáng))：碧云天生物技術(shù)研究所。兔抗Ang-1一抗：武漢博士德生物技術(shù)有限公司。兔抗CD34一抗：美國Santa Cruz公司。小鼠抗β-actin一抗：北京中杉金橋生物有限公司。山羊抗兔IgG(H+L)-HRP：北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

SD大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射麻醉，將其仰臥固定，頸部常規(guī)消毒，頸正中切開大約2 cm，逐層鈍性分離出右側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)。結(jié)扎ECA分叉處和CCA的近心端，動脈夾夾閉ICA。用眼科剪在CCA上剪一切口，插入栓線18 mm，到達(dá)大腦前動脈起始處發(fā)現(xiàn)有阻擋感。一并結(jié)扎栓線和ICA，松開動脈夾，30 min后緩慢拔出線栓，縫合肌肉，碘酒消毒。假手術(shù)組操作方法相同，但不插線栓。

1.3.2 神經(jīng)功能行為學(xué)評分

采用Zea Longa 5分法進(jìn)行評分，1分：提鼠尾離地面約33 cm，不能充分伸展對側(cè)前肢；2分：對側(cè)前肢屈曲；3分：置于地面，向?qū)?cè)行走；4分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，呈追尾狀；5分：對側(cè)癱瘓，無法行走。

1.3.3 大鼠腦梗死體積的測定

SD大鼠連續(xù)給藥7 d后，腹腔注射麻醉大鼠，立刻斷頭取腦，放入大鼠腦槽模具中，并沿冠狀面切片，水平切5刀，每片厚度2 mm，共6片。切片放入5 mL的TTC染色液中，嚴(yán)格避光，15 min后，用眼科鑷將每片翻面，再染15 min后取出，可觀察到正常腦組織呈紅色，而梗死組織區(qū)域呈白色[15]，放入4%多聚甲醛中固定24 h，取出腦片用濾紙吸干，放掃描儀中進(jìn)行掃描，將照片導(dǎo)入計算機(jī)，用圖像分析軟件Image Pro-plus計算。按照如下公式計算：腦梗死體積百分比(%)=(腦片總梗死面積/腦片總面積)×100%。

1.3.4 Western blotting

術(shù)后第8天，SD大鼠麻醉處死，右側(cè)皮層腦組織新鮮取出，將其裂解，離心，取上清液BCA法進(jìn)行蛋白定量，通過10%～15%SDS-PAGE電泳，上樣后，先恒壓60 V電泳，待樣品從濃縮膠進(jìn)入分離膠時，調(diào)至120 V后至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜。室溫下在5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入按說明書稀釋比例后的Ang-1，CD34一抗，放4℃靜置過夜。用1×TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL顯色劑曝光。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件Quantity one中進(jìn)行分析，分別計算出目標(biāo)蛋白條帶灰度值(A值)，以A值/對應(yīng)β-actin的比值作為蛋白水平的定量指標(biāo)，進(jìn)行比較統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能行為學(xué)評分

術(shù)后0 d Zea Longa評分，模型組和劑量組大鼠均發(fā)生神經(jīng)功能損傷，且Zea Longa評分沒有統(tǒng)計學(xué)差異，提示造模成功，模型穩(wěn)定。與假手術(shù)相比，有顯著性差異 (P<0.001)；術(shù)后24 h給予莫諾苷7 d的后，莫諾苷大劑量組(270 mg/kg)與模型組比較，神經(jīng)功能行為學(xué)評分明顯降低(P<0.01)，說明大劑量莫諾苷在大鼠腦損傷可起到神經(jīng)保護(hù)作用。(圖1)

注：與假手術(shù)相比，###P<0.001; 與模型組相比，**P<0.01。圖1 MCAO后24 h給予莫諾苷對神經(jīng)功能評分的影響Note. Compared with the sham group,###P<0.001;Compared with the MCAO group, **P<0.01.Figure 1 Effect of morroniside administered at 24 h post-MCAO on the neurological score

2.2 腦梗死體積百分比

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死體積百分比顯著增加(P<0.001)。莫諾苷劑量組大鼠比模型組的腦梗死體積百分比減少，其中小和中劑量組與模型組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而大劑量組有顯著性差異(P<0.05)，說明大劑量莫諾苷可減少腦梗死體積。(圖2)

注：(A)各組大鼠TTC圖片；(B)各組大鼠梗死體積百分比的統(tǒng)計結(jié)果。與假手術(shù)組相比，###P<0.001; 與模型組相比， *P<0.05。圖2 MCAO后24 h給予莫諾苷對TTC染色的影響Note. (A) The picture of rats in all groups; (B) The statistical results of cerebral infarction volume ratios of rats in all groups.Compared with the sham group,###P<0.001; Compared with the MCAO group, *P<0.05.Figure 2 Effect of morroniside administered at 24 h post-MCAO on the cerebral infaction volumes

2.3 皮層血管新生相關(guān)蛋白CD34和Ang-1的表達(dá)

術(shù)后第8天，與假手術(shù)相比，模型組大鼠缺血側(cè)皮層CD34和Ang-1的蛋白表達(dá)均增加(P<0.05，P<0.05)。與模型組相比，莫諾苷小和中劑量組大鼠缺血側(cè)皮層CD34和Ang-1的表達(dá)水平有所增加，其中中劑量組大鼠缺血側(cè)皮層Ang-1表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)。莫諾苷大劑量組與模型組相比缺血側(cè)皮層CD34和Ang-1的表達(dá)顯著增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，說明大劑量莫諾苷在腦損傷后能更多的促使CD34和Ang-1的表達(dá)。(圖3、圖4)

注：(A)各組大鼠缺血側(cè)皮層CD34表達(dá)水平；a:假手術(shù)組;b:模型組;c:莫諾苷小劑量組;d:莫諾苷中劑量組;e:莫諾苷大劑量組。(B)各組大鼠缺血側(cè)皮層CD34相對表達(dá)定量結(jié)果。與假手術(shù)組相比，#P<0.05; 與模型組相比，**P<0.01，。圖3 MCAO后24 h給予莫諾苷對CD34表達(dá)的影響Note. (A) The expression level of CD34 in ischemic hemisphere of rats in all groups; a:Sham; b:MCAO; c:Morroniside low-dose group; d:Morroniside moderate-dose group; e: Morroniside high-dose group.(B) The relative expression level of CD34 in ischemic hemisphere of rats in all groups,。Compared with the sham group,#P<0.05; Compared with the MCAO group,**P<0.01.Figure 3 Effect of morroniside administered at 24 h post-MCAO on the CD34 expression

注：(A)各組大鼠缺血側(cè)皮層Ang-1表達(dá)水平；a:假手術(shù)組;b:模型組;c:莫諾苷小劑量組;d:莫諾苷中劑量組;e:莫諾苷大劑量組。(B)各組大鼠缺血側(cè)皮層Ang-1相對表達(dá)定量結(jié)果。與假手術(shù)組相比，#P<0.05; 與模型組相比，*P<0.05。圖4 MCAO后24 h給予莫諾苷對Ang-1表達(dá)的影響Note. (A) The expression level of CD34 in ischemic hemisphere of rats in all groups; a:Sham; b:MCAO; c:Morroniside low-dose group; d:Morroniside middle-dose group; e: Morroniside high-dose group. (B) The relative expression quantitative level of CD34 in ischemic hemisphere of rats inall groups. Compared with the sham group, #P<0.05; Compared with the MCAO group, *P<0.01.Figure 4 Effect of morroniside administered at 24 h post-MCAO on the Ang-1 expression

3 討論

缺血性腦卒中是引起全球第二大常見死亡原因和致殘原因。目前臨床上普遍認(rèn)為使用重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)靜脈溶栓是最為有效治療方式[16]，但其具有狹窄治療時間窗，病人很少能在發(fā)病后4～5 h得到有效溶栓，因此亟需探索新的治療方法。有研究表明，在缺血早期抗炎、抗凋亡，缺血后期通過促進(jìn)血管新生、神經(jīng)發(fā)生可以使組織修復(fù)與再生[17-18]。莫諾苷是從中藥山茱萸中篩選出的有效成分，經(jīng)前期研究表明，大鼠MCAO模型術(shù)后3 h給予莫諾苷，可促進(jìn)血管長期生成，從而改善微血管循環(huán)，減少梗死體積并恢復(fù)神經(jīng)功能[10, 12]。本研究基于前期研究，擴(kuò)大其治療時間窗，發(fā)現(xiàn)大鼠腦損傷后24 h給予大劑量莫諾苷，也可促進(jìn)血管新生，改善神經(jīng)功能，起到保護(hù)作用。

腦損傷后，其恢復(fù)過程復(fù)雜且富有動態(tài)性，而梗死周邊血液供應(yīng)的恢復(fù)對改善神經(jīng)功能至關(guān)重要[19]。血管新生可減輕受損腦組織氧氣和營養(yǎng)的供應(yīng)不足，作為一種長期的天然防御機(jī)制。CD34+細(xì)胞是骨髓單核細(xì)胞(BMMNC)的子集，是造血和內(nèi)皮細(xì)胞前體的主要內(nèi)源性來源細(xì)胞[20]。在外周血中CD34+細(xì)胞含量極少，但腦損傷后，在動員劑作用下，從骨髓遷移至外周，最后歸巢于腦梗死缺血區(qū)，分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生和修復(fù)[21]。因此，CD34作為觀察血管新生的重要指標(biāo)。本研究表明，腦損傷后，與對照組相比，模型組CD34蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05)，提示CD34+細(xì)胞遷移至外周，與Paczkowska 等的研究結(jié)果一致[22]。而給予大劑量(270 mg/kg)莫諾苷，與模型組比較，可使CD34蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.01)。血管生成素-1(Ang-1)是調(diào)節(jié)血管生成的生長因子，可阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并刺激其增值[23]。因此，Ang-1對于新生血管的形成、重塑、成熟起著十分重要的作用，其蛋白的表達(dá)水平與缺血周邊區(qū)的血管發(fā)生密切相關(guān)。本研究顯示，與模型組相比，給予中(90 mg/kg)，大(270 mg/kg)劑量莫諾苷能顯著促進(jìn)Ang-1蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，提示造模后24 h給予莫諾苷可能對血管新生有一定的促進(jìn)作用。有研究表明，血管生成的生長因子不僅能促進(jìn)血管新生，減少大腦梗死體積，而且可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，遷移和分化[24]，改善神經(jīng)功能。本門課題組為了進(jìn)一步驗證，造模后24 h給予莫諾苷是否對腦梗死體積和神經(jīng)功能有影響。本課題組進(jìn)行了TTC染色和Zea Longa評分。本研究結(jié)果也顯示，莫諾苷大劑量組與模型組相比，顯著降低了神經(jīng)功能評分(P<0.01)，且明顯降低腦梗死體積(P<0.05)。

綜上所述，局灶性腦缺血再灌注24 h后給予莫諾苷治療后，CD34和Ang-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加，促進(jìn)腦梗死灶周邊血管新生，減少腦梗死體積，從而有利于恢復(fù)神經(jīng)功能。