袁 兵，李潤峰，楊春光，張 晟，張?jiān)戚x，角建林，張榮平，夏雪山，楊子峰*

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸健康研究院(呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心)，廣州 510120；2. 云南省第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，昆明 650032；3. 昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，昆明 650500；4. 昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心，昆明 650500； 5. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明650505)

流感疾病嚴(yán)重威脅人類健康[1]，目前常用于流感疾病研究的小鼠、雪貂等動(dòng)物模型由于與人類種屬差異過大，藥物預(yù)見性較差，如小鼠流感致病機(jī)制與人類存在較大差異[2]，臨床模擬性和藥物預(yù)見性較差，多種經(jīng)小鼠模型驗(yàn)證有效的抗炎藥止步于臨床試驗(yàn)[3]；另外小鼠、雪貂等模型動(dòng)物在抗流感藥物藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面與人相比差異較大，如人類口服奧司他韋的生物利用度大于75%[4]，但是小鼠和雪貂的生物利用度僅為30%和11%[5]。因此開發(fā)一種能有效復(fù)制人類流感疾病特征和良好藥物預(yù)見性的新型動(dòng)物模型，對(duì)于開發(fā)和篩選新的抗流感藥物或疫苗的療效，評(píng)估抗病毒治療方案具有重要價(jià)值。

樹鼩(Tupaiabelangeri,familyTupaiidae)是一種形似松鼠的小型哺乳動(dòng)物，在我國主要分布于云南、貴州、廣西等地區(qū)。2013年中科院昆明動(dòng)物所科學(xué)家發(fā)現(xiàn)樹鼩與靈長類親緣關(guān)系比小鼠等常用動(dòng)物模型更為接近，在很多方面具有可用來替代獼猴等大型靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)[6]，已在病毒性感染疾病等多種疾病模型中獲得廣泛應(yīng)用[7-8]，在上世紀(jì)80年代樹鼩已用于流感病毒研究[9]。本課題組進(jìn)一步證實(shí)樹鼩在流感癥狀、病毒復(fù)制，呼吸道受體分布等方面較其他常見流感動(dòng)物模型與人流感疾病特征更具模擬性[10]，然而抗流感藥物在樹鼩動(dòng)物模型上的藥代動(dòng)力學(xué)以及藥效學(xué)研究方面卻未見報(bào)道。為開發(fā)這一新的動(dòng)物資源，本研究通過檢測奧司他韋在樹鼩體內(nèi)血漿中代謝產(chǎn)物濃度變化，估算其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并與其他動(dòng)物模型的奧司他韋藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較，為奧司他韋在樹鼩體內(nèi)的合理用藥提供依據(jù)，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究口服奧司他韋在樹鼩體內(nèi)能否有效抑制流感病毒排毒，以及對(duì)流感疾病癥狀的影響，為驗(yàn)證樹鼩是一個(gè)具有良好藥物治療預(yù)見性的流感動(dòng)物模型提供客觀的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)野生馴養(yǎng)樹鼩80只，雌性，100～155 g， 12～15月齡，購自昆明醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部 [SCXK(滇) 2013-0002]。購置后于昆明理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心BSL-3級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中IVC裝置籠具中飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn) [SYXK(滇) 2011- 0004]。實(shí)驗(yàn)程序符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求，動(dòng)物使用的倫理審批號(hào)IACUC：KMU2017-M0016，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 病毒

人甲型流感病毒株(A/California/04/2009 H1N1)和A/Duck/HK/Y280/97 H9N2禽流感病毒突變株(H9N2 Y280-PB2-E627K)由香港大學(xué)惠贈(zèng)；犬腎傳代細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，由廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器

磷酸奧司他韋(批號(hào)：SC-18802)購自江蘇倍達(dá)醫(yī)藥科技有限公司；F-12/DMEM培養(yǎng)液(批號(hào)：8117019)、胎牛血清(批號(hào)：10270-106)、0.25%胰蛋白酶Trypsin(批號(hào)：25200-056)、青霉素/鏈霉素溶液(100x)(批號(hào)：15140-122)購自美國GIBCO公司；TPCK胰酶(批號(hào)：T1426)購自美國Sigma公司；戊巴比妥鈉(批號(hào)：P3761)購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；大鼠IVC獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具(蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)用樹鼩取血清經(jīng)血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測證實(shí)A/California/04/2009 H1N1和A/Duck/HK/Y280/97 H9N2抗體為陰性，將動(dòng)物隨機(jī)進(jìn)行以下分組：①奧司他韋藥代動(dòng)力學(xué)組：根據(jù)經(jīng)口灌胃口服奧司他韋后取血時(shí)間，將樹鼩分為0，0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8 和12 h組，每組4只，共計(jì)40只。②A/California/04/2009 H1N1感染組：樹鼩隨機(jī)分為A/California/04/2009 H1N1病毒組，奧司他韋高劑量(40 mg/(kg·d))給藥組，奧司他韋低劑量(4 mg/(kg·d))給藥組，每組6只動(dòng)物，共計(jì)18只樹鼩，每只樹鼩經(jīng)鼻接種A/California/04/2009 H1N1病毒106TCID50/250 uL。③H9N2 Y280-PB2-E627K感染組：樹鼩隨機(jī)分為H9N2禽流感病毒組，奧司他韋高劑量給藥組，奧司他韋低劑量給藥組，每組6只動(dòng)物，共計(jì)18只樹鼩，每只樹鼩經(jīng)鼻接種H9N2 Y280-PB2-E627K病毒106TCID50/250 μL。④正常對(duì)照組：設(shè)4只對(duì)照組，經(jīng)鼻接種250 μL PBS。

1.3.2 奧司他韋藥代動(dòng)力學(xué)研究

40只樹鼩禁食12 h(自由飲水)后，經(jīng)口灌胃給予奧司他韋10 mg/kg，首次灌胃給藥后記錄給藥時(shí)間，分別于給藥后0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8 和12 h經(jīng)尾靜脈或股靜脈采血0.5 mL，方法同文獻(xiàn)[10]，采集到的血液置于含肝素離心管中, 1500 r/min 4℃離心10 min，血漿轉(zhuǎn)移至EP管中置-80℃深低溫冰箱保存。

精確稱取適量磷酸奧司他韋、羧基奧司他韋及內(nèi)標(biāo)帕拉米韋，用90%甲醇水溶液制成約1 mg/mL儲(chǔ)備液，其中磷酸奧司他韋需折算成奧司他韋濃度，然后用甲醇逐級(jí)稀釋成梯度工作溶液；內(nèi)標(biāo)帕拉米韋用甲醇配成1 μg/mL的工作溶液。分別取10 μL磷酸奧司他韋和羧基奧司他韋工作溶液，加入50 μL空白樹鼩血漿，再加入130 μL含內(nèi)標(biāo)帕拉米韋的工作溶液，渦旋混合離心10 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析，其中磷酸奧司他韋血漿濃度依次為0.1、0.5、2.5、5.0、10、50、100、 200、 400、 800、 1500 ng/mL，羧基奧司他韋血漿濃度依次為 2.5，5.0，10，25，50， 250， 500， 2000和4000 ng/mL。，以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程，經(jīng)線性擬合，奧司他韋在0.1至200 ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，線性方程為：y=0.00412x+0.000616 (r=0.97)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得各血樣檢測結(jié)果，及對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)和藥時(shí)曲線。

NOS1AP基因rs12742393位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)瑞格列奈治療我國漢族2型糖尿病患者療效的影響 …………… 王 濤等（10）：1347

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of the analytes

1.3.3 奧司他韋治療對(duì)樹鼩鼻腔排毒和細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

稱取動(dòng)物體質(zhì)量，按奧司他韋高劑量和低劑量計(jì)算每日給藥總劑量，分兩次給藥，于病毒接種前2 h給藥，每日給藥兩次，連續(xù)給藥5 d。每日觀察樹鼩鼻部癥狀，樹鼩感染后第1、3和5天經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，吸取600 μL無菌PBS，從樹鼩一側(cè)鼻孔緩慢滴入，用90 mm2平皿收集鼻灌洗液，鼻灌洗液經(jīng)800 r/min 離心取上清適量分裝，鼻灌洗液沉淀進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，收集的鼻灌洗液檢測病毒滴度TCID50。

1.3.4 血清抗體效價(jià)檢測

A/California/04/2009 H1N1和H9N2 Y280-PB2-E627K病毒感染組樹鼩(包括病毒組，奧司他韋高劑量/低劑量給藥組)飼養(yǎng)至病毒感染后第21天行安樂死，心臟取血后收集血清，分裝至EP管中，-80℃保存?zhèn)溆?，通過血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測血清病毒中和抗體滴度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 樹鼩及其他動(dòng)物模型奧司他韋藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Pharmacokinetic parameters of oseltamivir in the tree shrews and other animal models

2 結(jié)果

2.1 樹鼩與其他幾種流感動(dòng)物模型藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

樹鼩口服給予磷酸奧司他韋10 mg/(kg·d)，給藥后血漿中奧司他韋的藥時(shí)曲線見圖2：樹鼩口服奧司他韋給藥后血漿中活性成分羧基奧司他韋的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：高峰血藥濃度(Cmax)為1.34 μg/mL, 達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為0.75 h，血清清除半衰期(T1/2)為2.03 h，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-12)為1.76 mg·h/liter。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)[5,11-12]比較其與大鼠、小鼠、雪貂及人口服奧司他韋后相應(yīng)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異(表1)。

2.2 奧司他韋對(duì)樹鼩感染H9N2 Y280-PB2-E627K和A/California/04/2009 H1N1流感病毒藥效學(xué)研究

在治療后第1天，奧司他韋高劑量給藥組樹鼩鼻腔H9N2病毒排毒被明顯抑制，至第3天奧司他韋高劑量給藥組樹鼩鼻腔已無排毒，病毒組和奧司他韋低劑量給藥組鼻腔排毒明顯減少(圖3A)；但樹鼩感染A/California/04/2009 H1N1病毒后治療第1天和第3天，奧司他韋對(duì)各組鼻腔排毒滴度基本沒有影響，至治療第5天時(shí)奧司他韋高劑量給藥組樹鼩鼻腔排毒較病毒組明顯下降，有3/5的樹鼩未再檢出A/California/04/2009 H1N1流感病毒，而病毒組和奧司他韋低劑量給藥組鼻腔灌洗液排毒雖然較前降低，但所有樹鼩仍有排毒(圖3B)。

感染H9N2 Y280-PB2-E627K和A/California/04/2009 H1N1流感病毒后，部分樹鼩鼻腔灌洗液中黃色粘稠分泌物增多，在感染后第3天鼻腔灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)增加至高峰，細(xì)胞以上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，其中高劑量奧司他韋能夠明顯抑制H9N2 Y280-PB2-E627K病毒感染組鼻腔細(xì)胞總數(shù)(圖4 A)，但對(duì)A/California/04/2009 H1N1病毒感染各組鼻腔細(xì)胞總數(shù)無影響(圖4B)。

2.3 奧司他韋對(duì)樹鼩感染H9N2 Y280-PB2-E627K和A/California/04/2009 H1N1流感病毒血清抗體影響

樹鼩感染人甲型流感病毒A/California/04/2009 H1N1和禽流感病毒H9N2 Y280-PB2-E627K后均能產(chǎn)生相應(yīng)抗體，人甲型流感病毒A/California/04/2009 H1N1感染后產(chǎn)生的抗體效價(jià)(640-2560)明顯高于禽流感病毒H9N2 Y280-PB2-E627K產(chǎn)生的抗體效價(jià)(160-640)，奧司他韋抗病毒治療對(duì)流感病毒抗體產(chǎn)生無明顯影響(表2)。

3 討論

奧司他韋口服吸收后可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物奧司他韋羧酸鹽[13]，以人體代謝為例，奧司他韋活性代謝物在血漿中可在30 min內(nèi)檢測到，并在3～4 h后達(dá)到最大濃度，半衰期6～10 h[12]，本項(xiàng)目藥代動(dòng)力學(xué)檢測結(jié)果顯示奧司他韋在樹鼩體內(nèi)的高峰血藥濃度、達(dá)峰時(shí)間、血清清除半衰期(T1/2)、血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-12)等與大鼠、雪貂和人各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)間相差較大，僅藥物達(dá)峰時(shí)間和血漿清除半衰期與小鼠相近，這些參數(shù)可在一定程度上指導(dǎo)奧司他韋在樹鼩的應(yīng)用。本研究中樹鼩個(gè)體間藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異比較大，這可能與所用樹鼩為野生馴養(yǎng)樹鼩，遺傳背景差異較大有關(guān)，研究人員可在后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過增大樹鼩數(shù)量，以減少數(shù)據(jù)之間的誤差。

注：與病毒組相比，*P<0.05。圖3 不同毒株感染奧司他韋治療后樹鼩排毒滴度Note. Compared to the virus group, *P<0.05.Figure 3 Viral shedding in the tree shrews infected with different viruses after oseltamivir treatment

注：與病毒組相比，*P<0.05。圖4 不同毒株感染奧司他韋治療后樹鼩鼻灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)Note. Compared to the virus group, *P<0.05.Figure 4 Cell count in the nasal cavity lavage of tree shrews infected with different viruses after oseltamivir treatment

病毒Virus分組Groups血清效價(jià)(平均值,血清抗體效價(jià)范圍)Seroconversion(mean,HI titer range)H9N2(A/Duck/HK/Y280/97 H9N2)病毒組 Virus group213,160～320高劑量給藥組High dose group224,160～320低劑量給藥組Low dose group347,160～640H1N1(A/California/04/2009 H1N1)病毒組Virus group960,640～1280高劑量給藥組High dose group1067,640～1280低劑量給藥組Low dose group1600,640～2560

注：高劑量給藥量(40 mg/(kg·d))；低劑量給藥量(4 mg/(kg·d))。

Note. High dose(40 mg/(kg·d));Low dose(4 mg/(kg·d)).

在藥效學(xué)研究中，課題組借鑒人采用每天兩次，每次75 mg，共5 d足以抑制季節(jié)性流感病毒毒株的神經(jīng)氨酸酶活性[14-15]特點(diǎn)，同時(shí)根據(jù)樹鼩與人類及其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體表面積進(jìn)行等效劑量換算[16]，以及前期實(shí)驗(yàn)樹鼩鼻腔排毒時(shí)間(4～6 d)，確定本研究奧司他韋給藥劑量高劑量為40 mg/(kg·d)，低劑量為4 mg/(kg·d)，給藥時(shí)間為5 d。本研究中樹鼩感染A/California/04/2009 H1N1和H9N2 Y280-PB2-E627K流感病毒后，鼻腔可有效復(fù)制，規(guī)律排毒，其中感染人A/California/04/2009 H1N1病毒后鼻腔排毒滴度、排毒時(shí)間均大于感染H9N2 Y280-PB2-E627K禽流感病毒，甚至長于課題組先前的樹鼩感染人甲型流感病毒(A/PR/8/34，GZ/02/09和SOIV/GZ/07/09)排毒時(shí)間[10]，其可能原因與所用的A/California/04/2009 H1N1流感病毒屬于2009年大流行人甲型流感病毒，對(duì)模型動(dòng)物具有較強(qiáng)的致病力和毒力[17]，另一方面也可能與經(jīng)鼻腔接種病毒劑量高于先前實(shí)驗(yàn)(105TCID50)有關(guān)。奧司他韋羧酸鹽屬于選擇性流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑[12]，能夠有效抑制病毒從被感染的細(xì)胞中釋放，從而減少流感病毒的傳播[18]，樹鼩口服奧司他韋對(duì)其鼻腔排毒具有抑制作用，但不同給藥劑量以及不同感染毒株之間存在較大差異，高劑量奧司他韋對(duì)A/California/04/2009 H1N1和H9N2 Y280-PB2-E627K流感病毒的抑制作用強(qiáng)于低劑量給藥，其中對(duì)感染H9N2 Y280-PB2-E627K病毒樹鼩的排毒抑制作用明顯高于感染A/California/04/2009 H1N1病毒樹鼩，這種差異一方面與所用毒株A/California/04/2009 H1N1毒力明顯高于H9N2 Y280-PB2-E627K，奧司他韋在感染初期不能有效抑制樹鼩鼻腔H1N1病毒復(fù)制，另一方面與奧司他韋對(duì)不同毒株的抑制作用存在差異有關(guān)[19]。

樹鼩感染人甲型流感病毒A/California/04/2009 H1N1后產(chǎn)生的抗體效價(jià)明顯高于H9N2 Y280-PB2-E627K禽流感病毒感染產(chǎn)生的抗體效價(jià)，其原因可能與流感毒株類型和毒力有關(guān)[20]，病毒毒力強(qiáng)的毒株可產(chǎn)生的較高的抗體滴度，血清中產(chǎn)生的中和抗體，對(duì)病毒再感染可產(chǎn)生積極的免疫力[21]。而感染相同病毒的不同給藥組和病毒組之間抗體效價(jià)接近，說明奧司他韋對(duì)病毒抗體效價(jià)的產(chǎn)生沒有影響。課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)H9N2 Y280-PB2-E627K流感病毒感染能夠促進(jìn)機(jī)體分泌炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，本研究中發(fā)現(xiàn)樹鼩感染A/California/04/2009 H1N1和H9N2 Y280-PB2-E627K流感病毒后，在部分樹鼩鼻灌洗液中含有黃色粘稠分泌物，細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，以第3天為高峰，說明與其他模型動(dòng)物研究類似，流感病毒感染可導(dǎo)致樹鼩鼻部粘膜出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[22]，增加的細(xì)胞包括上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞，炎性細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，而上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞能夠分泌炎性細(xì)胞因子[23]，促進(jìn)與流感病毒感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)。而高劑量奧司他韋給藥組可以有效抑制了H9N2 Y280-PB2-E627K病毒復(fù)制，導(dǎo)致該組樹鼩鼻腔中的細(xì)胞總數(shù)無明顯上升，說明奧司他韋抗流感藥物可以通過降低流感病毒滴度，減少流感相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

綜上，磷酸奧司他韋治療能夠降低樹鼩鼻腔排毒，減輕相關(guān)炎癥反應(yīng)，說明該模型具有一定藥物治療預(yù)見性，可將其應(yīng)用于抗病毒藥物優(yōu)化劑量研究[13]，對(duì)機(jī)體有損害副作用的抗病毒藥物[24]發(fā)生機(jī)制研究，以及耐藥或新發(fā)流感病毒的致病機(jī)理研究，為流感疾病的研究提供了一個(gè)有效的動(dòng)物平臺(tái)工具。