趙 敏，田 暢，邸 鑫，金 鑫，叢 珊，劉伽瑩，李然偉，王 珂*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2.泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春130041)

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的最惡性腫瘤，預(yù)計(jì)2018年新增肺癌病例210萬例，死亡180萬例，占癌癥死亡人數(shù)的五分之一(18.4%)[1]。肺癌通常分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[2]。我國每年新發(fā)肺癌病例約73.3萬例，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80%-85%[3]。肺癌患者五年總生存率為17%，而臨床IV期的肺癌患者的五年生存率低于2%[4]。因此積極探索肺癌的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的肺癌相關(guān)生物標(biāo)志物對(duì)改善肺癌患者的治療和預(yù)后至關(guān)重要。

RNA結(jié)合基序蛋白-5(RNA binding motif 5， RBM5)是RBM(RNA Binding Motif)家族成員之一，也是RBM家族中最受關(guān)注的成員。RBM5 (也被稱為 g15、LUCA-15及H37)位于假定的人類腫瘤抑制基因區(qū)域3p21.3。這個(gè)區(qū)域共有19個(gè)基因，這19個(gè)基因都在不同程度上表現(xiàn)出了相應(yīng)的腫瘤抑制作用，RBM5位于這19個(gè)基因的末端[5-7]。RBM5主要分布于細(xì)胞核，具有識(shí)別、結(jié)合RNA，參與機(jī)體內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖以及調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡等功能，目前研究證實(shí)，RBM5是潛在的腫瘤抑制因子[8]。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病中起了非常重要的作用，尤其在腺癌的發(fā)病過程中。研究表明，80%的NSCLCs患者，EGFR的表達(dá)增高[9]；20%的肺癌患者組織中(多見于支氣管肺泡癌及腺癌)HER2的表達(dá)增高[10]；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在許多不同病理類型的肺癌中，鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)的表達(dá)明顯增高。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)[11]：腺癌病人的KRAS、EGFR及HER2的基因突變多與吸煙史有關(guān)。例如：EGFR的基因突變多見于無吸煙史的腺癌病人(尤其是亞洲女性)；而KRAS的基因突變多見于有吸煙史的腺癌及鱗癌病人(非亞裔男性)；KRAS的基因突變也見于無吸煙史的腺癌病人，但其突變類型不同于有吸煙史的腺癌及鱗癌病人。

本課題組[12]前期研究已經(jīng)證實(shí)：在人非小細(xì)胞肺癌組織中腫瘤抑制基因RBM5表達(dá)降低，癌基因EGFR,KRAS表達(dá)增高，提示RBM5基因表達(dá)缺失與EGFR,KRAS基因過表達(dá)共同參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生。在人非小細(xì)胞肺癌中RBM5蛋白表達(dá)水平與EGFR、KRAS蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，RBM5可能作為EGFR途徑的上游基因，可在體內(nèi)微環(huán)境中，通過增加RBM5表達(dá)下調(diào)EGFR、KRAS水平的途徑，抑制肺癌組織、細(xì)胞增殖。

對(duì)驅(qū)動(dòng)基因及突變基因的檢測(cè)是針對(duì)NSCLC患者國內(nèi)、外診治的共識(shí)，但該技術(shù)因所需組織標(biāo)本取材困難，操作流程繁瑣，周期長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備要求高，故難以推廣，且目前大多數(shù)研究項(xiàng)目及臨床應(yīng)用主要是針對(duì)已經(jīng)診斷的肺癌或肺癌晚期病人，從而指導(dǎo)NSCLC患者靶向用藥方案，故組織中目的基因的檢測(cè)尚不能也不適合做到NSCLC早期診斷及療效評(píng)估。而本實(shí)驗(yàn)將組織中基因水平的檢測(cè)，轉(zhuǎn)化為血清中目的蛋白的檢測(cè)，相比較于組織的取材困難，患者血清的獲得較為簡(jiǎn)單，而基因水平的檢測(cè)也較蛋白水平的檢測(cè)較為繁瑣，故如果血清中驅(qū)動(dòng)基因和突變基因表達(dá)水平與組織中具有較高的相似性，我們便可以用血清中目的基因表達(dá)水平的檢測(cè)來代替組織中目的基因的檢測(cè)，從而做到NSCLC早期診斷及療效評(píng)估。

本研究通過測(cè)定組織及血清中上述基因表達(dá)水平，比較組織與血清表達(dá)水平差異，分析三者與臨床病理類型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，吸煙史，年齡，性別等的關(guān)系；從而為非小細(xì)胞肺癌的精準(zhǔn)診治提供更方便快捷的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2017年8月至2018年8月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院收治的44例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者作為實(shí)驗(yàn)組，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理或支氣管鏡活檢病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌(其中有2例經(jīng)支氣管鏡活檢病理證實(shí)，故只有血清，無癌組織與癌旁組織)。其中鱗狀細(xì)胞癌22例，腺癌22例；按照國際肺癌研究學(xué)會(huì)(IASLC)2017年頒布的第8版肺癌TNM分期[13]進(jìn)行劃分：Ⅰ期10例，Ⅱ期21例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例。其中男性32例，女性12例，年齡為46-78歲，平均年齡為61.00±7.27歲；選取同期健康體檢人22例作為對(duì)照組，其中男性10人，女性12人，年齡為47-83歲，平均年齡61.00±11.05歲；經(jīng)相關(guān)檢查未發(fā)現(xiàn)肺癌或其他腫瘤性疾病。

1.2入組標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)非小細(xì)胞肺癌入組患者結(jié)合臨床癥狀、體征，均經(jīng)病理學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌，均具有完整的病歷資料。排除存在嚴(yán)重心臟及肝腎疾病、自身免疫性疾病、嚴(yán)重并發(fā)癥等情況患者。

1.3主要試劑和儀器Light Cycler 480Ⅱ高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏,美國)，TransZol Up PLUS RNA Kit(北京全是金生物技術(shù)有限公司，中國)， TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal) (北京全是金生物技術(shù)有限公司，中國),DNA引物合成(生工生物有限責(zé)任公司，中國)，TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全是金生物技術(shù)有限公司，中國)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天，中國)，兔抗RBM5多克隆抗體(生工生物工程(上海)股份有限公司，中國)Human EGFR ELISA KIT(R&D，美國),Human KRAS ELISA KIT(R&D，美國)，Human RBM5 ELISA KIT(江萊生物，中國)，Thermo Scientific Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(賽默飛世爾科技，美國)

1.4RT-QPCR法檢測(cè)組織中RBM5、EGFR、KRASmRNA表達(dá)水平用Trizol法提取上述肺癌及癌旁組織標(biāo)本中總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,RT-PCR法檢測(cè)RBM5、EGFR、KRAS的相對(duì)表達(dá)水平，引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。根據(jù)Ct值采用法計(jì)算癌及癌旁組織目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，△Ct值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.5Westernblot法測(cè)定組織中RBM5、EGFR、KRAS蛋白表達(dá)水平采用RIPA裂解緩沖液冰上裂解組織，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣品取30 μg上樣，10%SDS-PAGE,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂乳封閉2 h，與上述基因抗體(按說明書稀釋比例稀釋)，4℃孵育過夜。經(jīng)PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(稀釋比例1∶2000)，室溫?fù)u床孵育40 min，TBST洗滌3次，加入ECL顯色，采用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參采用β-actin。

1.6ELISA法測(cè)定NSCLC和正常人血清中RBM5、EGFR及KRAS蛋白表達(dá)水平嚴(yán)格按RBM5、EGFR和KRAS檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，檢測(cè)RBM5、EGFR和KRAS的表達(dá)水平。加樣，37℃溫育30 min，洗滌5次，加酶標(biāo)抗體50 μl，溫育、洗滌，加顯色液顯色，檢測(cè)其吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出RBM5、EGFR和KRAS的水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布,使用t檢驗(yàn)或Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1肺組織中RBM5、EGFR和KRASmRNA及蛋白表達(dá)水平

肺癌和癌旁組織中上述基因mRNA表達(dá)水平(2Δct)均呈非正態(tài)分布。

2.1.1癌旁組織RBM5 mRNA的表達(dá)水平最小值為1.77×10-3，最大值為3.73，中位數(shù)為4.54×10-2，95%區(qū)間距為0.051-0.655。肺癌組織RBM5 mRNA的表達(dá)水平最小值為5.45×10-3，最大值為0.33，中位數(shù)為3.35×10-2，95%區(qū)間距為0.034-0.071；肺癌組織中RBM5 mRNA的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)。

2.1.2癌旁組織EGFR mRNA的表達(dá)水平最小值為4.14×10-3，最大值為0.30，中位數(shù)為3.65×10-2，95%區(qū)間距為0.036-0.094。肺癌組織EGFR mRNA的表達(dá)水平最小值為17.74×10-3，最大值為1.10，中位數(shù)為5.04×10-2，95%區(qū)間距為0.028-0.168。肺癌組織中EGFR mRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

癌旁組織KRAS mRNA的表達(dá)水平最小值為0.80×10-3，最大值為0.99，中位數(shù)為2.59×10-2，95%區(qū)間距為0.073-0.288。肺癌組織KRAS mRNA的表達(dá)水平最小值為6.92×10-3，最大值為0.97，中位數(shù)為5.53×10-2，95%區(qū)間距為0.116-0.311；肺癌組織中KRAS mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織,但二者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。非小細(xì)胞肺癌組織中RBM5蛋白質(zhì)表達(dá)水平較癌旁組織降低，EGFR蛋白水平升高，KRAS表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。(圖1)。

P:para-carcinoma tissues;T:tumor

Fig.1ExpressionofRBM5,EGFRandKRASproteininNSCLCtissueandpara-tumortissuebyWesternblot

2.1.3其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌EGFR mRNA表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌EGFR mRNA表達(dá)水平(P<0.05)；與癌旁組織對(duì)比，男性組、低年齡組、無吸煙史組、鱗癌組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組癌組織中RBM5 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；高年齡組、無吸煙史組及腺癌組，組織中EGFR mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；臨床Ⅰ期以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，非小細(xì)胞肺癌組織中KRAS mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)(表3)。

Tab.2 Levels of RBM5,EGFR and KRAS mRNA in NSCLC

Tab.3 Association of RBM5,EGFR,and KRAS mRNA with clinicopathological characteristics in NSCLC

*：There was significant difference between tumor and para-carcinoma tissues (P<0.05);#:The specific clinical categories in cancer tissues were significantly different (P<0.05).

2.2血清中RBM5、EGFR和KRAS蛋白表達(dá)水平

血清中上述基因蛋白表達(dá)水平均呈正態(tài)分布，正常對(duì)照組中的RBM5蛋白表達(dá)水平為(7.74±1.98 ng/ml)，肺癌患者血清中RBM5蛋白表達(dá)水平為(4.74±1.62 ng/ml)，肺癌患者血清中RBM5蛋白表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RBM5蛋白表達(dá)水平(4.18±1.19 ng/ml)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RBM5蛋白表達(dá)水平(5.30±1.81 ng/ml)(P<0.05)；正常對(duì)照組中的EGFR蛋白表達(dá)水平為(7.61±1.91 ng/l)，肺癌患者血清中EGFR蛋白表達(dá)水平為(10.51±2.37 ng/l)，肺癌患者血清中EGFR蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。正常對(duì)照組中的KRAS蛋白表達(dá)水平為(2.97±0.71 ng/ml)，肺癌患者血清中KRAS蛋白表達(dá)水平為(3.82±1.13 ng/ml)，肺癌患者血清中KRAS蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)(圖2)。

Fig.2 Levels of serum RBM5,EGFR and KRAS protein ；**：P<0.01vs control group

3 討論

目前肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡率最高的腫瘤性疾病，每年死亡率18.4%[1]。近年來新型肺癌相關(guān)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用對(duì)于改善肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌的早期診斷、治療及預(yù)后起到至關(guān)重要的作用。大量研究結(jié)果顯示：RBM5是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄和mRNA剪接的核蛋白。在神經(jīng)鞘瘤和75%原發(fā)肺癌樣本中發(fā)現(xiàn)RBM5的表達(dá)明顯低于正常組織[14,15]。而目前關(guān)于EGFR和KRAS在癌癥中的研究已經(jīng)證明：EGFR是由細(xì)胞外配體結(jié)合域和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域組成的170kD跨膜糖蛋白，它在許多上皮性腫瘤中異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后差，而更重要的是在40%至85%的初級(jí)NSCLC可以檢測(cè)到EGFR的表達(dá)[16]。RAS家族三個(gè)成員在細(xì)胞中的突變廣泛發(fā)生在多種人類癌癥中，其中KRAS的突變是RAS家族成員中最常見的。RAS家族中大約在30%的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)了突變；當(dāng)然，這其中也包括肺癌[17]。在本研究中，利用RT-qPCR法對(duì)RBM5、EGFR及KRAS在NSCLC組織與癌旁組織的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示RBM5在癌組織中的表達(dá)含量明顯較癌旁組織低,EGFR的表達(dá)含量明顯升高，KRAS沒有明顯相關(guān)性，并且經(jīng)過Western blot驗(yàn)證組織蛋白質(zhì)也符合這一趨勢(shì)，這與梁紅[12]等人的研究結(jié)論相似。進(jìn)一步分析三種基因與臨床及病理相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在男性組、低年齡組、無吸煙史組、鱗癌組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組癌組織中RBM5 mRNA表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)。高年齡、無吸煙史及腺癌組，非小細(xì)胞肺癌組織中EGFR mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。臨床Ⅰ期以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，非小細(xì)胞肺癌組織中KRAS mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。根據(jù)Amos CI[18]的報(bào)道：只有不到11%的重度吸煙者最終發(fā)展成惡性腫瘤，提示吸煙與NSCLC的發(fā)病并無特定關(guān)系。相關(guān)研究人員同樣證明吸煙對(duì)3p21.3這一片段抑癌作用并沒有明顯影響[19]，而我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出非吸煙者中癌與癌旁組織中RBM5和EGFR表達(dá)含量差異顯著，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)論也補(bǔ)充了無吸煙組的RBM5表達(dá)水平癌與癌旁組織差異大。而在Snjezana Dogan[20]發(fā)現(xiàn)EGFR突變?cè)?3%的不吸煙者(NS)和11%的吸煙者中。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與其相符，在無吸煙史的癌組織中EGFR表達(dá)明顯高于癌旁組織。相關(guān)研究表明，EGFR通路在細(xì)胞增殖、血管生成和存活中起重要作用。鑒于其對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡、血管生成、腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移的影響，它顯然與腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展有關(guān)[21]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌EGFR mRNA表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌EGFR mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。這可以指導(dǎo)我們更好的應(yīng)用EGFR的靶向治療藥物治療非小細(xì)胞肺癌。

目前已有多項(xiàng)[22]研究論證了檢測(cè)血清中EGFR表達(dá)含量作為肺癌診斷指標(biāo)的可行性；而Dr.Ryan[23]課題組得出血清中KRAS2突變體是結(jié)直腸腫瘤復(fù)發(fā)臨床癥狀表現(xiàn)前的潛在標(biāo)志；目前還沒有任何關(guān)于血清RBM5與癌癥的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示血清RBM5、EGFR及KRAS在健康者及非小細(xì)胞肺癌中都有表達(dá)，并且在非小細(xì)胞肺癌患者血清中RBM5表達(dá)水平低于健康者(P<0.05)，而EGFR和KRAS表達(dá)高于健康者(P<0.05)。此結(jié)果與組織中RBM5、EGFR的結(jié)果具有高度相似性，但也得出KRAS在非小細(xì)胞肺癌患者血清中高表達(dá)這一結(jié)論，此結(jié)論與梁紅[12]等人在測(cè)定癌組織中KRAS表達(dá)情況時(shí)，得出結(jié)論一致，以上結(jié)果提示血清RBM5、EGFR及KRAS可作為非小細(xì)胞肺癌患者新的血清標(biāo)志物。Oh等人[19]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制因子RBM5/H37改變參與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的表達(dá)，表明RBM5表達(dá)的缺失可能增加腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能。我們的研究結(jié)果得出伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清中RBM5表達(dá)含量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中血清中，證實(shí)了RBM5表達(dá)降低與轉(zhuǎn)移相關(guān)的臨床病理特征之間的顯著關(guān)聯(lián)，支持上述研究。該結(jié)論也與彭杰等人[24]在研究胰腺導(dǎo)管癌中RBM5與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性得出的結(jié)論類似。提示血清RBM5可能是預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)指標(biāo)，與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。

綜上所述，RBM5和EGFR在非小細(xì)胞肺癌患者無論是病理標(biāo)本還是血清中都存在相同趨勢(shì)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性，而我們檢測(cè)到KRAS只在NSCLC患者血清中有明顯升高，在此推測(cè)腫瘤抑制基因RBM5在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中起到負(fù)性調(diào)控作用，而EGFR和KRAS起到正性調(diào)控作用；血清中RBM5和EGFR可能成為判斷腫瘤早期轉(zhuǎn)移新指標(biāo)以及腫瘤新治療靶點(diǎn)。

作者簡(jiǎn)介：趙敏(1994-)，內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市人，在讀醫(yī)學(xué)碩士；王珂，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師。