劉 寧，史永鋒，關(guān)一諾，趙 青，吳 迪，武軍鐸，高大松，劉 斌*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春130041；2.長(zhǎng)春恒晨生物科技有限公司)

心力衰竭(heart failure ，HF)是一種心臟疾病的終末期臨床綜合征，可由多種心臟疾病引發(fā)。在我國(guó)，心力衰竭發(fā)病率為0.9%，患病率隨著年齡增加顯著上升[1]。心力衰竭患者的表現(xiàn)及病癥大多類(lèi)似，但是病因往往各不相同，且大多數(shù)患者很難查到確切的病因。因此給疾病的治療帶來(lái)了很大的困難，找到一種特殊的靶向物質(zhì)，針對(duì)靶向物質(zhì)檢測(cè)心力衰竭是迫切需要的。

腦啡肽酶(Neprilysin,NEP)也稱(chēng)中性內(nèi)肽酶，是一種膜結(jié)合的金屬內(nèi)肽酶[2]。上世紀(jì)90年代，研究人員合成NEP抑制劑并與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)聯(lián)合使用治療心力衰竭取得了一定進(jìn)展[3]。近些年來(lái)，腦啡肽酶作為心力衰竭診斷的新靶點(diǎn)受到了極大的關(guān)注[4]。目前，已有相關(guān)報(bào)道證實(shí)NEP可以作為HF患者的病理生物標(biāo)志物。本研究旨在研究腦啡肽穩(wěn)定性是否適合作為心力衰竭生物學(xué)標(biāo)志，以及研究其在血清中含量與活性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

采用腦啡肽酶檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)(長(zhǎng)春恒曉生物科技有限責(zé)任公司)測(cè)定血液樣本中的腦啡肽酶含量；采用腦啡肽酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定血液樣本中腦啡肽酶活性。測(cè)試所用儀器為賽默飛世爾酶標(biāo)儀Varioskan LUX， 美國(guó)。

1.2 研究方法

1.2.1標(biāo)本采集

抽取心力衰竭患者空腹血液2 ml，于非抗凝管中。采集后的血液4℃保存，并在4 h內(nèi)3 000 rpm離心10分鐘，緩慢吸出上層血清，轉(zhuǎn)入EP管中。

1.2.2檢測(cè)方法

(1)血清中NEP穩(wěn)定性研究：將30個(gè)心力衰竭患者的血清放入一個(gè)50 ml離心管中，渦旋混勻后分裝，每管200 μl。將獲得的多管混合血清分組，分別放入-80℃、-20℃和4℃中保存。以-80℃中的樣本作為對(duì)照組，測(cè)定4℃保存8 h、12 h、16 h和24 h的樣本中NEP含量。同樣，以-80℃中的樣本作為對(duì)照組，測(cè)定-20℃保存7 d、14 d、21 d和28 d的樣本中NEP含量。

(2)血清中NEP含量及酶活性相關(guān)性研究：分別用NEP含量檢測(cè)試劑盒和NEP酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)試40例患者血清中的NEP。通過(guò)相關(guān)性分析比對(duì)，血清中NEP含量及活性關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x—±s)表示，各組數(shù)據(jù)間采用t檢驗(yàn)；P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中NEP的穩(wěn)定性研究

研究結(jié)果表明(表1)，分離后的血清在4℃中保存24 h之內(nèi)，其性質(zhì)穩(wěn)定，未見(jiàn)顯著下降(P>0.05)。-20℃保存的血清其保存穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)(表2)，-20℃保存的血清28 d后其含量下降并不顯著(P>0.05)。

表1 4℃保存血清中NEP穩(wěn)定性(pg/ml)

表2 -20℃保存血清中NEP穩(wěn)定性(pg/ml)

2.2 血清中NEP含量及酶活性關(guān)系的研究

采用NEP濃度測(cè)量和酶活性測(cè)量試劑盒對(duì)同一批患者血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析(圖1)，可已看出血清中NEP含量與酶活性成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2為0.7017，二者相關(guān)性較強(qiáng)。

圖1 血清中NEP濃度與酶活性相關(guān)性

3 討論

NEP作為膜結(jié)合蛋白，與 其他類(lèi)似蛋白有著相同的性質(zhì)，即可以從細(xì)胞膜表面釋放，產(chǎn)生保持催化活性的非膜相關(guān)形式[5]。早在30年前，科研人員就發(fā)現(xiàn)血清中的NEP活性與急性呼吸窘迫綜合征和心源性肺水腫相關(guān)[6]。而最近才有研究提供證據(jù)，顯示NEP在心力衰竭患者中可作為病理學(xué)生物標(biāo)志替代物[7]。

有研究人員評(píng)估了1069個(gè)慢性心衰患者，患者中主要是射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭(HFrEF)患者[5]，通過(guò)多因素復(fù)雜分析NT-proBNP與可溶性NEP與患者的住院及死亡風(fēng)險(xiǎn)有顯著的相關(guān)性。直接比較NT-proBNP與可溶性NEP可以發(fā)現(xiàn)NEP在神經(jīng)激素調(diào)節(jié)中的核心作用。此外，研究顯示可溶性NEP受合并癥影響較強(qiáng)，尤其是腎功能障礙和肥胖癥的影響[8]。而在射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭(HFpEF)患者中，可溶性NEP的表達(dá)量與預(yù)后并無(wú)顯著相關(guān)性。一些研究人員還發(fā)現(xiàn)，BNP水平高的患者血液中可溶性NEP水平也較高，但是研究人員沒(méi)有研究他們與預(yù)后的關(guān)系[9]。

以往的這些研究都預(yù)示著可溶性NEP可以作為一種診斷心力衰竭的新的生物學(xué)標(biāo)記物。然而，目前各種檢驗(yàn)NEP水平的實(shí)驗(yàn)都需要進(jìn)一步的完善和驗(yàn)證。綜合先前的研究，研究報(bào)告中可溶性NEP均保存在-80℃中，但是沒(méi)有實(shí)驗(yàn)人員對(duì)可溶性NEP在血清中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。要作為可診斷的生物學(xué)標(biāo)記物，需要有一定的穩(wěn)定性，本研究發(fā)現(xiàn)從人血清中的NEP在4℃環(huán)境中可以保存24 h，在-20℃中可以保存28 d，其穩(wěn)定性與-80℃中保存的樣本其含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。這說(shuō)明人血清中的可溶性NEP具有較好的穩(wěn)定性，基本可以滿足臨床檢測(cè)對(duì)樣本儲(chǔ)存和復(fù)檢的需求。

另外，還有一點(diǎn)值得注意的是NEP是成熟中性粒細(xì)胞的表面標(biāo)記[10]，因此適當(dāng)離心和樣本分離是防止不必要的膜結(jié)合NEP污染的關(guān)鍵。在適當(dāng)離心之后，血清樣本原則上是非細(xì)胞的，而血漿可能含有殘留的細(xì)胞物質(zhì)，會(huì)對(duì)結(jié)果分析造成混淆，因此本實(shí)驗(yàn)選擇血清作為實(shí)驗(yàn)樣本。

通過(guò)對(duì)之前研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究人員選擇研究NEP在血液中的濃度來(lái)研究其對(duì)心力衰竭患者的診斷作用。而NEP作為一種酶，其在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用主要體現(xiàn)在他的酶活性強(qiáng)弱方面。因此了解血液樣本中NEP含量與NEP酶活性之間的關(guān)系，對(duì)其研究有一定指導(dǎo)性的意見(jiàn)。本研究通過(guò)對(duì)40例心衰患者血液樣本同時(shí)檢測(cè)NEP含量及活性，結(jié)果顯示，在人血液樣本中NEP含量及活性成正相關(guān)(r2=0.7017)，相關(guān)性較強(qiáng)。因此可以通過(guò)研究血液中NEP的含量來(lái)了間接顯示其酶活性強(qiáng)弱。

綜上所述，NEP在人血樣本中較穩(wěn)定，可以滿足臨床檢測(cè)對(duì)樣本儲(chǔ)存及保留復(fù)檢的要求。結(jié)合之前的研究結(jié)果，NEP有望成為心力衰竭診斷的生物學(xué)標(biāo)記。只是檢測(cè)方法還需要研究人員不斷完善。