韓 睿，李清廉，劉 銳，盧蕻迪,孫建偉，徐保鋒*，許 侃*

(1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 a.神經(jīng)血管病外科;b.腫瘤科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 內(nèi)分泌科)

缺血性腦卒中是導(dǎo)致成人殘疾的主要原因，在世界范圍內(nèi)一直是一個(gè)公共衛(wèi)生問題[1]。全球每隔2秒就有人出現(xiàn)癥狀性中風(fēng)[2]。盡管最近在治療中風(fēng)的藥理學(xué)方面取得了進(jìn)展，但如何進(jìn)一步改善預(yù)后的問題亟待解決。據(jù)報(bào)道，70%-80%的中風(fēng)幸存者存在嚴(yán)重的軀體和認(rèn)知障礙，尤其是中風(fēng)后肢體痙攣，這已成為一個(gè)日益嚴(yán)重的社會(huì)問題[3]。至于鈣通道阻滯劑、抗氧化劑/自由基清除劑，甚至尿激酶、瑞替普酶和其他藥劑的混合劑，由于治療時(shí)間窗短和/或藥物的嚴(yán)重毒副作用，仍然缺乏有效的治療，甚至有些藥物缺乏有力的證據(jù)[4]。因此，研發(fā)高效、低毒副作用的治療藥物已迫在眉睫。

雖然許多神經(jīng)保護(hù)劑已在動(dòng)物研究中被廣泛證實(shí)有效，但在臨床上很少有效。最近，人們提出了一種治療復(fù)雜疾病如動(dòng)脈粥樣硬化的更好方法可能是針對(duì)一些靶點(diǎn)[5]。多重藥理可能在這一領(lǐng)域提供一種解決方案[5，6]。包含多種草藥、礦物質(zhì)及多種成分的中藥可作用于多個(gè)靶點(diǎn)并發(fā)揮協(xié)同治療作用[5]。血必凈注射液(XBJ)是中藥標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品，已被用于治療膿毒癥及其相關(guān)的多器官功能障礙綜合征(MODS)，但最近已被應(yīng)用于腦損傷患者，其療效已通過臨床應(yīng)用得到證實(shí)[7]。血必凈注射液是從丹參、紅花、白芍、川芎和當(dāng)歸中提取，具有活血化瘀、通絡(luò)解毒的作用[7]。越來越多的證據(jù)表明，XBJ或其主要化學(xué)成分可通過抗炎和(或)抗氧化應(yīng)激保護(hù)大鼠腦和心肌細(xì)胞免受I/R損傷[7-9]。

因此，本研究旨在通過建立大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)的腦缺血模型，探討XBJ的潛在作用并闡明其潛在的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

化學(xué)品：渥曼青霉素(wortmannin)，2.3.5-三苯基四唑氯化物(TTC)購(gòu)自Invitrogen公司(Carlsbad，CA，美國(guó))。從細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司(Beverly，MA，美國(guó))獲得的大鼠Akt和磷酸化Akt(P-Akt)ELISA試劑盒。其他所有化學(xué)品，除非另有說明，都是購(gòu)自西格瑪化學(xué)公司(St.Louis，MO，美國(guó))。

1.2 動(dòng)物

成年雄性SD大鼠(200-250 g)，由開復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(中國(guó)長(zhǎng)沙)。將大鼠飼養(yǎng)在12 h光/暗循環(huán)中，食物和水自由采食。所有的動(dòng)物處置均嚴(yán)格按照國(guó)際倫理準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.3 動(dòng)物模型制備

如前所述，缺血性腦損傷模型由MCAO的方法制作[10，11]。通過腹腔注射劑量為36 mg/kg的戊巴比妥麻醉動(dòng)物。在大鼠麻醉后，通過鈍性分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。然后將帶有熱圓形尖端的尼龍縫合線插入頸內(nèi)動(dòng)脈而閉塞大腦中動(dòng)脈(MCA)，縫合線沿著頸內(nèi)動(dòng)脈逐步向前推進(jìn)，直到其接近MCA的起始部。假手術(shù)對(duì)照組大鼠予以相同的手術(shù)處理過程但不插入縫合線。

1.4 分組

50只大鼠隨機(jī)分為5組(每組n=10,2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色5只,Elisa染色5只):(1)假手術(shù)組：未予以MCAO處置的大鼠。(2)對(duì)照組：在制備MCAO模型前30 min腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg)。(3)XBJ組：與對(duì)照組相同，在制備MCAO模型前30 min腹腔注射XBJ(10 ml/kg)[12，13]。(4)XBJ+WM組：與對(duì)照組相同，但在制備MCAO模型前30 min腹腔注射XBJ(10 ml/kg)，腦室注射wortmannin(0.25 mg/kg)+DMSO 1 ml。(5)WM組：與對(duì)照組相同，但制備MCAO模型前30 min腦室注射wortmannin(0.25 mg/kg)+DMSO 1 ml。

1.5 梗死體積

麻醉大鼠后，小心將大腦從顱骨中取出，將腦組織切成2 mm厚的切片，切片在1%TTC溶液中于37°C孵育30 min，如先前所詳細(xì)描述的那樣，在線拍攝梗塞區(qū)域后，使用Image pro測(cè)量梗死區(qū)域[14]。

1.6 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

研究人員在不知道每只大鼠的治療條件的情況下，根據(jù)五點(diǎn)量表在24 h后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為定量評(píng)分：0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，不能充分伸展左前爪；2分，向左旋轉(zhuǎn)；3分，向左跌倒；4分，無法自發(fā)行走或意識(shí)水平低下[10]。1-4分被認(rèn)為是有用的模型。

1.7 裂解caspase-3活性試驗(yàn)

在手術(shù)后24小時(shí)，通過硫代巴比妥酸法測(cè)量裂解的caspase-3活性。腦組織勻漿制備如下：將100 mg組織樣品在0.9 ml冰冷的生理鹽水中勻漿，然后以2 000 rpm離心15 min。根據(jù)說明書使用分光光度計(jì)測(cè)量裂解的caspase-3的數(shù)量。

1.8 檢測(cè)腦組織內(nèi)AKT、P-AKT蛋白的表達(dá)

大鼠AKT和P-AKT Elisa試劑盒(均為雙抗體夾心ELISA試劑盒)被用于檢測(cè)AKT，P-AKT蛋白。經(jīng)過24 h后，在冰上處死大鼠并取出它們的腦組織并在-50℃冷凍10分鐘。然后取出來自第三腦切片(2 mm厚)的缺血性半暗帶的1.5 g腦組織，以制備如前所述的勻漿[13]。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以x—±s表示。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梗死體積

正如預(yù)期的那樣，假手術(shù)組未觀察到腦梗死體積，而其他各組均有不同體積的腦梗死(對(duì)照組：44.8±9.21；XBJ組：19.98±6.72；XBJ + WM組：30.24±7.27；WM 組：42.65±8.11)。與對(duì)照組相比，XBJ明顯減少M(fèi)CAO模型的梗死體積(見圖1)。當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用XBJ和WM時(shí)，XBJ的作用明顯減弱。然而，WM組與對(duì)照組梗死體積相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05，與對(duì)照組相比)。

2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

由Longa提出的5點(diǎn)量表被用來評(píng)估神經(jīng)功能缺損[10]。正如預(yù)期的那樣，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分，這意味著該組中沒有神經(jīng)功能缺損，與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，其他各組均有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)改變，對(duì)照組為2.81±0.745，XBJ組為1.21±0.458，XBJ+WM組為1.89±0.642，WM組為2.72±0.620。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，XBJ可顯著降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但XBJ + WM組中，XBJ的神經(jīng)保護(hù)作用出現(xiàn)一定程度的降低(見圖2)。WM組與對(duì)照組神經(jīng)功能缺損評(píng)分相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1各組的梗死體積：假手術(shù)組為0，與對(duì)照組相比，XBJ組明顯降低MCAO模型的梗死體積(P<0.01)。但當(dāng)XBJ聯(lián)合WM時(shí)，發(fā)現(xiàn)WM削弱了XBJ的療效，而單獨(dú)使用WM時(shí)，與對(duì)照組比較，無顯著差異(*P<0.01與對(duì)照組(n=5)相比)。

圖2各組的神經(jīng)學(xué)評(píng)分：假手術(shù)組神經(jīng)功能評(píng)分為0，MCAO模型中，XBJ組神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(*P<0.05與對(duì)照組相比)。

2.3 裂解caspase-3

手術(shù)后24 h，通過免疫組織化學(xué)染色法測(cè)量皮質(zhì)中裂解的caspase-3。如圖3結(jié)果顯示，XBJ組裂解的caspase-3為0.61±0.12，對(duì)照組為1.26±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，XBJ+WM組裂解的caspase-3為0.78±0.11，通過與XBJ組相比較可以看出XBJ的作用被部分逆轉(zhuǎn)。WM組和對(duì)照組裂解的 caspase-3相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖3各組裂解的caspase-3活性：假手術(shù)組裂解caspase-3活性在所有組中最低。XBJ組裂解的caspase-3活性明顯低于對(duì)照組。在XBJ+WM組中，與XBJ組相比，效果部分減弱。對(duì)照組和WM組之間沒有差異(*P<0.05與對(duì)照組相比，#P<0.05與假手術(shù)組相比)。

2.4 AKT蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，Akt蛋白在各組均有表達(dá)，假手術(shù)組為0.092±0.009，對(duì)照組為0.108±0.011，XBJ組為0.112±0.01，XBJ+WM組為0.096±0.007，WM組為0.11±0.01，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖4)。

圖4Akt蛋白表達(dá)：各組中均表達(dá)較低水平的Akt，組間對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.5 P-Akt蛋白表達(dá)

如圖5結(jié)果顯示，在假手術(shù)組中p-Akt(0.109±0.011)的表達(dá)水平極低。XBJ組p-Akt蛋白表達(dá)為0.471±0.025，對(duì)照組p-Akt蛋白表達(dá)為0.405±0.013，與對(duì)照組相比，經(jīng)XBJ處理可顯著增加p-Akt蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。XBJ+WM組p-Akt蛋白表達(dá)為0.423±0.012，與XBJ組相比，wortmannin可顯著降低p-Akt蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。WM組p-Akt蛋白表達(dá)為0.274±0.043，與對(duì)照組相比，wortmannin也顯著降低p-Akt蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5各組中p-Akt的表達(dá)：假手術(shù)組p-Akt的表達(dá)極低，而與對(duì)照組相比，XBJ組MCAO模型中p-Akt的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。在XBJ+WM組中，WM可明顯減輕XBJ的這種作用，與對(duì)照組相比，WM組中的wortmannin可明顯降低p-Akt的表達(dá)(*P<0.05與假手術(shù)組相比，#P<0.05與對(duì)照組相比)。

3 討論

缺血性卒中可誘發(fā)腦損傷，神經(jīng)功能缺損甚至死亡。以往的研究表明，藥物和再灌注療法對(duì)于缺血性卒中的治療效果并不理想[15，16]。因此，作為缺血性卒中期間和之后的神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)，細(xì)胞凋亡的重要性得到充分強(qiáng)調(diào)[17]。PI3K/Akt通路在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用，并被認(rèn)為與腦缺血后的病理生理學(xué)過程相關(guān)。眾所周知，Akt是細(xì)胞存活的關(guān)鍵介質(zhì)，Akt激活的延長(zhǎng)是防止細(xì)胞凋亡的重要條件[19]。目前越來越多的中藥治療缺血性心腦血管疾病，且具有良好的臨床療效[5,7,20]。XBJ是中藥標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品，在抗凋亡、抗氧化、抗炎等多種病理生理機(jī)制上表現(xiàn)出強(qiáng)大的功效。

在腦缺血損傷過程中，細(xì)胞凋亡和壞死是細(xì)胞死亡的兩種基本類型[21]。壞死作為一種不可逆的被動(dòng)變性過程，其特征在于細(xì)胞膜完整性喪失和細(xì)胞崩解，而細(xì)胞核基本保持完整。細(xì)胞凋亡作為一種可逆的活性細(xì)胞自殺過程，其形態(tài)學(xué)特征在于細(xì)胞核萎縮、碎裂、細(xì)胞凝聚、膜泡化和凋亡小體形成。最近的研究結(jié)果暗示了中風(fēng)動(dòng)物模型中缺血性腦損傷后神經(jīng)元變性的細(xì)胞凋亡[22]。Caspase-3能酶促消化特異性底物并抑制DNA修復(fù)酶，從而導(dǎo)致染色體斷裂成小片段并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前caspase激活(前體蛋白酶切割成活性caspase)被一致認(rèn)為是幾乎所有凋亡系統(tǒng)的標(biāo)志。

本研究數(shù)據(jù)顯示，XBJ減輕MCAO誘導(dǎo)的腦缺血損傷，其特征是減少梗死體積，裂解caspase-3，降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分和增加p-Akt蛋白表達(dá)，然而wortmannin可部分逆轉(zhuǎn)XBJ的這些作用。XBJ的保護(hù)機(jī)制可能是通過PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦提示XBJ對(duì)于缺血性腦卒中具有保護(hù)作用。XBJ可能是在發(fā)生缺血性腦卒中事件后一種極有希望的保護(hù)性干預(yù)措施，但未來還需要更多的的臨床試驗(yàn)研究所證實(shí)。

綜上所述，通過XBJ預(yù)處理誘導(dǎo)的p-Akt增加和阻斷經(jīng)XBJ預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用的PI3K抑制劑Wortmannin，表明PI3K/Akt信號(hào)通路參與大鼠腦損傷過程。換言之，在缺血性卒中發(fā)作前約30分鐘，XBJ誘導(dǎo)MCAO大鼠減少腦梗死體積和減輕神經(jīng)功能缺損而發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用可能部分歸因于PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。這也是首次證明PI3K/Akt信號(hào)通路與XBJ對(duì)大腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用之間的關(guān)系。