周龍梅

（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司上海研發(fā)中心，上海 201203）

防腐劑在日化產(chǎn)品中的主要功能是抑制細(xì)菌繁殖，以防止產(chǎn)品變質(zhì)或產(chǎn)生毒素，同時防腐劑還有助于產(chǎn)品穩(wěn)定和產(chǎn)品存儲。在公眾消費(fèi)者的壓力下，全球各個國家對禁用和限用的日化原料成分的管制更加嚴(yán)格，允許使用的防腐劑將越來越少。

許多學(xué)者研究了乳酸桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的具有抑菌性能的物質(zhì)，該物質(zhì)可用于食品防腐劑[1,2]。Chun Chia Chen[3]等從植物乳桿菌發(fā)酵液中提取出的抗菌物質(zhì)能抑制變種鏈球菌。A.R.Sarika[4]等從鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液中提取出了具有抗菌活性的物質(zhì)，Sigrid C.J.De Keersmaecker[5]等研究了從鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液中提取的抗菌物質(zhì)能抑制鼠傷寒沙門氏桿菌。本研究參考文獻(xiàn)[6,7]從鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液中提取出抗菌活性物，該物質(zhì)經(jīng)實驗驗證對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌具有抑菌性能。將此抗菌物質(zhì)添加至護(hù)膚乳液中能有效抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌繁殖。該抗菌物質(zhì)添加到護(hù)膚品中，能抑制細(xì)菌繁殖，從而可延長產(chǎn)品貨架期，可以作為日用護(hù)膚品中合成防腐劑的替代品。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大腸埃希菌（Escherichia coli ATCC 8739）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）；白色念珠菌（Candida albicans （ATCC 10231）；以上菌種由中國普通微生物菌種保藏中心提供。

營養(yǎng)培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基，稀釋液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%滅菌生理鹽水）。

FM200弗魯克均質(zhì)攪拌器，上海弗魯克科技發(fā)展有限公司； HJ-3磁力加熱攪拌器，常州崢嶸儀器有限公司。

1.2 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液提取物制備

參照文獻(xiàn)[6,7]。鼠李糖乳桿菌在特定培養(yǎng)基中進(jìn)行28 h靜置發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液在75 ℃水浴中加熱1 h以滅活發(fā)酵液中的酶，發(fā)酵液冷卻后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酸堿度為6.5左右攪拌1 h，在5 ℃、7 500 r·min-1離心10 min，去除上清液收集沉淀，以去除發(fā)酵液中的過氧化氫、酶等物質(zhì)，沉淀用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%的滅菌生理鹽水懸浮洗滌2次，每次0.5 h，懸浮液在5 ℃、7 500 r·min-1離心10 min，去除上清液收集沉淀，進(jìn)一步去除過氧化氫、酶等物質(zhì)，2次洗滌后的沉淀用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%乳酸溶液進(jìn)行攪拌懸浮1 h，乳酸溶液用量為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液的1/30，懸浮液在5 ℃、7 500 r·min-1離心10 min，收集上清液去除沉淀，上清液再經(jīng)0.2 μm的微孔膜進(jìn)行過濾得鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液提取物。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%乳酸溶液的配制：在滅菌后的特定培養(yǎng)基溶液中加入氯化鈉至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%，然后加入乳酸至乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.36，經(jīng)過0.2 μm的微孔膜過濾得到含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%乳酸溶液。

采用凱氏定氮法[8]測定發(fā)酵提取物中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 抑菌圈實驗

抑菌圈實驗方法參考2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》。

將指示菌細(xì)菌在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中活化，35 ℃新鮮培養(yǎng)20 h，取菌懸液1 mL至9 mL稀釋液中進(jìn)行稀釋，稀釋至一定濃度（約108CFU·mL-1）；指示菌白色念珠菌在沙氏液體培養(yǎng)基中活化，35 ℃新鮮培養(yǎng)20 h，取菌懸液1 mL至9 mL稀釋液中，稀釋至一定濃度（約106CFU ·mL-1）。

先將6 mL固體培養(yǎng)基平鋪于平板中，置于水平臺面上靜置凝固，分別取1 mL稀釋至約108CFU·mL-1細(xì)菌或106CFU ·mL-1白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)指示菌與10 mL融化并溫?zé)岬墓腆w培養(yǎng)基（細(xì)菌為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌為沙氏瓊脂培養(yǎng)基）混勻，傾倒于平板中。將平板打開蓋使無菌空氣流通約0.5 h以利于細(xì)菌素擴(kuò)散。將牛津杯輕輕放置于平板上，將200 μL鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液提取物樣品加入牛津杯后于4 ℃冰箱中擴(kuò)散5 h，然后35 ℃培養(yǎng)24 h觀察抑菌圈。

1.4 護(hù)膚乳液樣品的配制

配方組成：I相：乳化劑（硬脂酸甘油酯、PEG-100硬脂酸酯），質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%；硬脂醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%；異壬酸異壬酯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%；二辛基醚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%；生育酚乙酸酯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%。黃原膠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%檸檬酸溶液，適量；1,3-丁二醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%；水加至質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%。

將I相混合加熱至75 ℃，同時將水和1,3-丁二醇混合加熱至75 ℃，然后將I相加入到水和1,3-丁二醇混合物中3 000 r·min-1均質(zhì)20 min，冷卻至40 ℃加入黃原膠，3 000 r·min-1均質(zhì)2 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物，再用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH得護(hù)膚乳液樣品。

以不添加鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物、10%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH為5.0的護(hù)膚乳液作為對比樣。

1.5 抑菌實驗

抑菌實驗方法參考美國藥典USP＜51＞ Antimicrobial effectiveness testing。

將1 mL培養(yǎng)好的指示菌液至9 mL稀釋液中進(jìn)行稀釋，將指示菌稀釋為1×108CFU·mL-1～1×109CFU·mL-1的菌懸液，確定細(xì)菌數(shù)。

將含鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物的護(hù)膚乳液調(diào)節(jié)pH為5.0、6.0、7.0進(jìn)行挑戰(zhàn)測試，評估其抑菌性能。將大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌接種至含有鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物乳液樣品中培養(yǎng)28天，在此期間定期測試樣品中存活微生物。

分別稱取pH為5.0、6.0及7.0含有鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物待測乳液樣品100 g，分別倒入9個帶蓋容器中；稱取對比樣品100 g，分別倒入3個帶蓋的容器中；分別標(biāo)記大、金、綠、pH及日期。

分別在9個容器中對應(yīng)加入1 mL 1×108CFU ·mL-1～1×109CFU ·mL-1的細(xì)菌菌懸液，混勻后蓋上蓋子；在對比樣品中對應(yīng)加入1 mL 1×108CFU ·mL-1～1×109CFU ·mL-1的細(xì)菌菌懸液，混勻后蓋上蓋子，置于（32.5±2.5）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

分別在7天、14天、28天分別計算樣品中活的細(xì)菌。每次計算完細(xì)菌總數(shù)后將平皿放回培養(yǎng)箱，以待下次觀察用，觀察中切勿打開平皿，以免染菌而使下次無法觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵提取物中蛋白質(zhì)含量及酸堿度測定

采用凱氏定氮法測定鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物中蛋白質(zhì)含量，由測定結(jié)果可知，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.246 4%；按照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》中pH測定方法測定發(fā)酵提取物pH為4.36。

2.2 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物抑菌圈實驗

圖1為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的抑菌圈實驗，圖中1表示鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取液抑菌圈，2表示質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%乳酸溶液抑菌圈。經(jīng)測定鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌抑菌圈直徑分別為19、23和24 mm，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物中的蛋白質(zhì)具有一定的抑菌性；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%乳酸溶液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌均無抑菌圈；發(fā)酵提取液和乳酸溶液對白色念珠菌均無抑菌圈。

圖1 抑菌圈實驗Fig.1 Inhibition zone test

2.3 含鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物乳液抑菌實驗

2.3.1 對大腸埃希菌抑菌實驗

圖2為乳液對大腸埃希菌的抑菌實驗。從圖2中可以看出，對比樣品在第14天及28天大腸埃希菌數(shù)量略有增加，說明對比樣品對大腸埃希菌沒有抑菌作用。pH為5.0、6.0及7.0的含有鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物的乳液在第7天對大腸埃希菌的抑菌率都能達(dá)到99.9%，14天、28天活菌數(shù)持續(xù)減少，抑菌率持續(xù)增大；從圖中還可以看出，pH影響鼠李糖發(fā)酵提取物對大腸埃希菌的抑菌性能，pH為5.0時對大腸埃希菌的抑菌性能最好。

圖2 乳液對大腸埃細(xì)菌的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of the lotion to Escherichia coli

2.3.2 對金黃色葡萄球菌抑菌實驗

圖3為乳液對金黃色葡萄球菌的抑菌實驗。從圖3中可以看出，對比樣品在第28天金黃色葡萄球菌數(shù)量略有增加，說明對比樣品對金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用。pH 為5.0、6.0及7.0的含鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物的乳液在第7天對金黃色葡萄球菌的抑菌率都能達(dá)到99.9%， 14天活菌數(shù)持續(xù)減少，28天pH6.0及pH7.0抑菌率持續(xù)增大，在28天pH5.0活菌數(shù)略有增加。

圖3 乳液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用Fig.3 Antibacterial effect of the lotion to Staphylococcus aureus

2.3.3 對銅綠假單胞菌抑菌實驗

圖4為乳液對銅綠假單胞菌的抑菌實驗。從圖4中可以看出，對比樣品在第28天銅綠假單胞菌數(shù)量幾乎不變，說明對比樣品對金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用。pH為5.0、6.0及7.0的含有鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物的乳液在第7天對銅綠假單胞菌抑菌率都能達(dá)到99.9%， 14天、28天活菌數(shù)持續(xù)減少，抑菌率持續(xù)增大；從圖中還可以看出， pH為5.0和 6.0時其抑菌性能相差不大。

圖4 乳液對銅綠假單胞菌的抑菌作用Fig.4 Antibacterial effect of the lotion to Pseudomonas aeruginosa

3 結(jié)論

鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取物含有一定量的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌具有顯著地抑制作用，對白色念珠菌沒有抑制作用。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的鼠李糖乳桿菌發(fā)酵提取液于護(hù)膚乳液中，能有效抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌。