任渝棠 姜 泊 林 欣

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所1(100084)清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：炎癥性腸病(IBD)是一種腸道自身免疫性疾病，具有不良臨床結(jié)局，目前其生物治療的靶點主要為促炎細胞因子。白細胞介素-23(IL-23)是近期被關(guān)注的重要促炎細胞因子，臨床試驗顯示針對IL-23亞基的單抗類藥物可能使IBD患者獲益。目的：應(yīng)用結(jié)腸炎小鼠模型，嘗試采用RNA干擾抑制IL-23表達，驗證其治療作用并探討可能的作用機制。方法：使用三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸建立結(jié)腸炎小鼠模型。模型動物分別經(jīng)尾靜脈注射IL-23 p19 shRNA慢病毒和對照shRNA慢病毒，同時設(shè)立不予干預(yù)的模型對照組。2周后行疾病活動指數(shù)和結(jié)腸組織炎癥活動度評分，采集血清和結(jié)腸組織檢測IL-23、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達水平，并檢測結(jié)腸組織Th17細胞數(shù)量。結(jié)果：IL-23 p19 RNA干擾治療能顯著降低結(jié)腸炎臨床和組織學(xué)活動度(P<0.05)，有效抑制IL-23表達(P<0.05)，減少結(jié)腸組織中的Th17細胞數(shù)量(P<0.05)，進而降低血清和結(jié)腸組織IL-17、TNF-α表達水平(P<0.05)。結(jié)論：以RNA干擾抑制IL-23表達對結(jié)腸炎小鼠模型具有治療作用，其機制在于抑制Th17細胞及其效應(yīng)細胞因子IL-17表達。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種自身免疫性腸道疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)。UC主要累及結(jié)腸，主要臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和黏液膿血便，重癥患者可發(fā)生中毒性巨結(jié)腸。CD可累及全消化道，包括食管、胃、小腸和結(jié)直腸，最常累及的部位是回盲部，主要臨床表現(xiàn)為腹痛和腹部包塊，可致腸道狹窄和瘺管形成。UC和CD均存在結(jié)直腸癌風(fēng)險，且與病程相關(guān)[1]。因此IBD病情的長期良好控制與其臨床結(jié)局有密切聯(lián)系。

藥物治療是IBD的主要治療方式，傳統(tǒng)治療藥物包括5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，近年來以各類細胞因子為靶點的生物制劑興起，作為“降階梯”治療，重癥、難治性或復(fù)發(fā)IBD患者早期使用可獲得更好的臨床結(jié)局，其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)單抗如英夫利西單抗和阿達木單抗、抗整合素α4β7的維多珠單抗以及最新的抗白細胞介素-12(IL-12)/23 p40的烏司努單抗均已進入臨床應(yīng)用[2-4]。

IL-23是近年來在IBD研究領(lǐng)域中被廣泛關(guān)注的促炎細胞因子，含有IL-23 p19和IL-12/23 p40兩個亞基。研究[5]發(fā)現(xiàn)CD和UC患者腸道黏膜IL-23 p19 mRNA表達顯著上調(diào)。一項回顧性觀察性研究[4]顯示，對TNF-α單抗抵抗的中重度CD患者，三分之二從IL-12/23 p40單抗治療中獲益。近期發(fā)表的IL-23 p19單抗Ⅱ期臨床試驗亦顯示其在中重度CD患者中誘導(dǎo)緩解效果顯著[6]。本研究應(yīng)用結(jié)腸炎小鼠模型，嘗試采用另一種生物學(xué)治療方式——RNA干擾抑制IL-23表達，驗證其治療作用并探討可能的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑和儀器

雄性BALB/c小鼠18只，6～8周齡，體質(zhì)量21～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma-Aldrich Co.)；IL-23 p19 shRNA慢病毒顆粒、對照shRNA慢病毒顆粒A(Santa Cruz Biotechnology)；IL-23、IL-17、TNF-α ELISA試劑盒、佛波酯/離子霉素/布雷非德菌素A/莫能霉素混合物(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；InvitrogenTMTRIzolTMRNA分離試劑(Thermo Fisher Scientific)；PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(Takara Bio Inc.)；抗鼠CD4抗體、抗鼠IL-17抗體(eBioscience, Thermo Fisher Scient-ific)。7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)；BD FACSCalibur流式細胞儀(BD Bio-sciences)。

二、方法

1. 結(jié)腸炎小鼠模型建立、分組和干預(yù)：使用TNBS建立急性期結(jié)腸炎小鼠模型，具體方法為：第1周第1 d TNBS 1.0 mg灌腸；第2周第1 d TNBS 2.5 mg灌腸[7]。將實驗小鼠隨機分為三組：模型對照組、對照shRNA慢病毒組(對照慢病毒組)和IL-23 p19 shRNA治療組，每組6只。后兩組在第1周和第2周第1 d分別經(jīng)尾靜脈注射對照shRNA慢病毒(50 μL, 2.5×105IFU)和IL-23 p19 shRNA慢病毒(50 μL, 2.5×105IFU)，模型對照組不予干預(yù)。IL-23 p19 shRNA靶目標(biāo)為小鼠IL-23 p19(GenBank No. NM_031252)。造模過程中觀察各組小鼠體質(zhì)量和排便情況，根據(jù)體質(zhì)量下降、糞便性狀和便血情況行疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)評分[8]。第2周末經(jīng)尾靜脈采血后斷頸處死小鼠，采集結(jié)腸組織標(biāo)本進行后續(xù)檢測。

2. 結(jié)腸組織病理學(xué)檢查：結(jié)腸組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，烘烤后二甲苯和乙醇脫蠟，HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)炎癥累及范圍、淋巴濾泡聚集程度、水腫、糜爛/潰瘍、隱窩消失、單核和多核細胞浸潤情況進行組織炎癥活動度評分[9]。

3. 血清IL-23、IL-17、TNF-α水平檢測：對IL-23、IL-17、TNF-α ELISA試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品進行稀釋，稀釋系列濃度分別為IL-23：80、40、20、10、5 pg/mL；IL-17：120、60、30、15、7.5 pg/mL；TNF-α：800、400、200、100、50 ng/L。酶標(biāo)板上設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加稀釋標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μL，再加待測血清10 μL。37 ℃溫育、洗滌后加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素50 μL(除空白孔)，再加入50 μL顯色底物四甲基聯(lián)苯胺，反應(yīng)后于分光光度計450 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度曲線計算樣品濃度。

4. Real-time PCR檢測結(jié)腸組織IL-23、IL-17、TNF-α mRNA表達：取100 mg結(jié)腸組織，加入1 mL TRIzolTM試劑提取總RNA，測定總RNA濃度。取5 μg 總RNA置于冰浴無RNA酶離心管中，加入引物Oligo(dT)16，70 ℃保溫5 min后迅速于冰上冷卻，然后加入dNTPs、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑，于實時熒光定量PCR系統(tǒng)中42 ℃溫浴60 min，95 ℃加熱終止反應(yīng)。以得到的cDNA為模板，加入IL-23、IL-17、TNF-α引物(表1)、Taq酶和SYBR熒光染料，行real-time PCR，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 Real-time PCR 目的基因和內(nèi)參引物序列

5. 流式細胞術(shù)檢測結(jié)腸組織Th17細胞：結(jié)腸組織勻漿過濾后，500×g離心5 min，取上清液，以紅細胞裂解液裂解約5 min。加入5 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，離心、洗滌后接種于24孔板，每孔加入佛波酯/離子霉素/布雷非德菌素A/莫能霉素混合物1 μL 混勻，細胞培養(yǎng)箱活化5 h。將活化細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入抗鼠CD4抗體、抗鼠IL-17抗體，PBS懸浮細胞后上BD FACSCalibur流式細胞儀分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、臨床和組織學(xué)評分比較

2周實驗結(jié)束時，IL-23 p19 shRNA治療組結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量顯著高于模型對照組和慢病毒對照組[(23.2±1.0) g、(20.0±1.2) g和(19.7±0.7) g,F=24.739,P<0.001](圖1A)；DAI顯著低于模型對照組和慢病毒對照組(3.2±0.3、3.9±0.2和3.9±0.3,F=13.986,P<0.001)(圖1B)；組織炎癥活動度評分亦顯著降低(7.8±1.3、16.0±1.7和15.3±1.3,F=61.527,P<0.001)(圖1C、1D)。

*三組間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型對照組與慢病毒對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)

二、血清IL-23、IL-17、TNF-α水平比較

IL-23 p19 shRNA能有效抑制結(jié)腸炎小鼠血清IL-23水平，治療組IL-23水平較模型對照組和慢病毒對照組顯著降低[(82.16±8.00) pg/mL、(101.94±5.19) pg/mL和(108.69±7.90) pg/mL,F=18.585,P<0.001](圖2A)，血清IL-17、TNF-α水平亦顯著降低[IL-17: (109.31±9.57) pg/mL、(126.14±10.17) pg/mL和(132.57±14.52) pg/mL,F=6.403,P=0.010; TNF-α: (800.16±49.26) ng/L、(910.31±76.86) ng/L和(887.40±41.86) ng/L,F=6.029,P=0.012](圖2B、2C)。

三、結(jié)腸組織IL-23、IL-17、TNF-α mRNA表達比較

IL-23 p19 shRNA能有效抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織IL-23 mRNA表達，治療組相對表達量較模型對照組和慢病毒對照組顯著降低(0.859±0.092、1.000和1.063±0.138,F=7.102,P=0.007)(圖3A)；結(jié)腸組織IL-17、TNF-α mRNA相對表達量亦顯著降低(IL-17 mRNA: 0.841±0.099、1.000和1.020±0.116,F=7.499,P=0.006; TNF-α mRNA: 0.775±0.090、1.000和1.128±0.103,F=30.859,P<0.001)(圖3B、3C)。

四、結(jié)腸組織Th17細胞數(shù)量比較

IL-23 p19 shRNA能有效減少結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的Th17細胞數(shù)量，治療組CD4+IL-17+細胞百分率較模型對照組和慢病毒對照組顯著降低(2.87%±0.59%、4.96%±0.47%和4.91%±0.65%,F=26.033,P<0.001)(圖4)。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)在模擬人類IBD的TNBS結(jié)腸炎小鼠模型中， IL-23 p19 shRNA治療可降低結(jié)腸炎臨床和組織學(xué)活動度，有效抑制全身和結(jié)腸局部IL-23、IL-17、TNF-α表達，減少結(jié)腸組織中的Th17細胞數(shù)量，提示IL-23 p19 shRNA可通過抑制IL-23表達，進而抑制Th17細胞增殖、活化及其效應(yīng)細胞因子IL-17產(chǎn)生，從而抑制TNF-α產(chǎn)生，控制結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)。

*三組間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型對照組與慢病毒對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)

*三組間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型對照組與慢病毒對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)

*三組間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型對照組與慢病毒對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)

IBD的發(fā)病具有復(fù)雜的免疫學(xué)機制。固有免疫系統(tǒng)和腸道黏膜屏障功能異常被認為是IBD發(fā)病的始動因素[10]。在遺傳易感性和環(huán)境刺激的綜合作用下，固有免疫系統(tǒng)中如腸上皮細胞、巨噬細胞或樹突細胞通過Toll樣受體(TLRs)識別腸道內(nèi)共生菌的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)，并將抗原呈遞給適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的Th細胞接受刺激信號后，分化為Th1和Th2兩種亞型。Th1細胞主要分泌IL-12和干擾素-γ(IFN-γ)，Th2細胞主要分泌IL-5和IL-13。傳統(tǒng)觀點認為Th1型免疫應(yīng)答主要與CD有關(guān)，而Th2型免疫應(yīng)答則與UC有關(guān)[11]。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通過上調(diào)促炎細胞因子、下調(diào)抗炎細胞因子活化固有免疫系統(tǒng)，并通過釋放自由基、細胞毒素、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、促炎細胞因子如TNF-α破壞腸黏膜，最終形成IBD。

此外，一組分泌IL-17的CD4+Th細胞也被發(fā)現(xiàn)參與了IBD的炎癥反應(yīng)過程，即Th17細胞。其位于腸道淋巴組織中，分泌IL-17A(即IL-17)和IL-17F，參與宿主防御反應(yīng)。Th17細胞在功能上具有“可塑性”，即一部分Th17細胞可向Th1特性轉(zhuǎn)化，同時分泌IL-17和IFN-γ[12]。CD和UC患者腸道黏膜中存在大量Th17細胞，相關(guān)細胞因子IL-17A、IL-17F呈高表達[13]，提示了Th17細胞在IBD免疫機制中的重要性。IL-17A和IL-17F在IBD中可能起有不同作用。研究[14]發(fā)現(xiàn)IL-17A基因敲除小鼠葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎加重，而IL-17F基因敲除小鼠結(jié)腸炎反而減輕。Th17細胞在IBD中的作用是IL-17A與IL-17F共同作用的結(jié)果。兩者參與粒細胞富集、活化和遷移，并作用于其他細胞，包括腸上皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞，促使其分泌IL-6、TNF-α、IL-1β和MMPs，促成活動性炎癥反應(yīng)[15]。

Th17細胞表達多個細胞因子受體，如IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、IL-23、IL-21、IL-1受體，其環(huán)境中常存在高水平的IL-6、TGF-β、IL-23，提示Th17細胞的生物學(xué)功能受這些細胞因子調(diào)控[16]。幼稚T細胞在IL-6、TGF-β的作用下表達轉(zhuǎn)錄因子RORγt和RORα，并分化為Th17細胞[17]。IL-6、TGF-β、IL-23均可刺激Th17細胞產(chǎn)生IL-17A和IL-17F[18]。IL-23并不促進幼稚T細胞向Th17細胞分化，但可促進Th17細胞增殖和存活，并促進其向Th1/Th17分化[19]。IL-23由IL-23 p19和IL-12/23 p40兩個亞基組成。有研究[20]發(fā)現(xiàn)IBD患者結(jié)腸組織中浸潤的中性粒細胞是腸道IL-23的主要來源。IL-23缺陷小鼠的 CD4+T細胞中檢測不到IL-17產(chǎn)生，提示IL-23為IL-17產(chǎn)生所必須[21]。因此抑制IL-23應(yīng)能抑制IL-23/Th17軸，從而控制IBD炎癥活動。

已有臨床研究證實了抑制IL-23/Th17軸的療效。對IL-12/23 p40單抗的療效觀察顯示，其在對TNF-α單抗抵抗的中重度CD患者中取得大于60%的臨床應(yīng)答率[4]。IL-23 p19單抗的Ⅱ期臨床試驗納入121例中重度CD患者(79%TNF-α單抗治療無效)，第12周時，治療組臨床緩解率顯著高于安慰劑組(31%對15%,P=0.048 9)[6]。除單抗類藥物外，還有研究者設(shè)計了針對IL-23 p19的疫苗，能在結(jié)腸炎小鼠模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度、長效IL-23 p19特異性IgG抗體，使模型小鼠IL-23、IL-12、IL-17表達水平顯著降低，結(jié)腸炎癥減輕[22]。

除針對細胞因子的單克隆抗體外，使用RNA干擾技術(shù)抑制基因表達亦為控制促炎細胞因子分泌的可行方案。與抗體類藥物相比，RNA干擾可以在腸道局部用藥，因此能避免全身免疫抑制，從而降低感染風(fēng)險。Wilson等[23]設(shè)計了一種包含TNF-α siRNA的口服納米顆粒，并證實其在結(jié)腸炎小鼠模型中能有效抑制結(jié)腸組織TNF-α mRNA表達，從而發(fā)揮保護作用。MMPs是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，參與IBD腸道組織炎癥活動。Kobayashi等[24]予DSS結(jié)腸炎小鼠模型腹腔注射針對MMP-3、MMP-10的siRNA，發(fā)現(xiàn)模型小鼠疾病臨床和組織學(xué)活動度均明顯降低。然而，以RNA干擾技術(shù)抑制促炎細胞因子基因表達的方法尚處于臨床前階段?？诜斯ず铣傻膕iRNA被認為是理想的給藥途徑，可直接作用于腸道以避免全身免疫抑制，但siRNA本身較脆弱，酸性環(huán)境和消化酶均能促進裸siRNA降解，腸上皮細胞攝取siRNA少，治療性siRNA較少到達黏膜固有層，且腸道內(nèi)siRNA可因誘發(fā)固有免疫應(yīng)答而被清除。盡管目前已設(shè)計出高分子納米載體或脂質(zhì)體保護siRNA，以利于其穿越黏膜上皮層，但生物安全性尚待研究。作用時間較短、需不間斷給藥以維持療效，是口服siRNA的又一缺陷。另一種RNA干擾方式為使用慢病毒作為RNA干擾載體，通常選用腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。整合干擾RNA的慢病毒可嵌合入宿主基因組，從而實現(xiàn)長期基因表達抑制，以達到長期治療作用。但慢病毒同樣存在生物安全性問題，目前尚無法判斷其本身是否具有致病性。

本研究主要存在以下兩點不足。其一，雖然IL-23 p19 shRNA治療組與兩組對照組在臨床和組織學(xué)評分、Th17細胞數(shù)量和IL-17表達方面存在顯著差異，但對結(jié)腸組織IL-23 mRNA表達的抑制效率偏低(<15%)，可能與本研究慢病毒注射量偏低(2.5×105IFU)或該病毒體內(nèi)感染效率偏低有關(guān)。一項采用慢病毒介導(dǎo)RNA干擾抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型TNF-α表達的研究[25]中，慢病毒注射采用了較本研究更高的劑量(1×107TU)，抑制率達到68.5%。Kobayashi等[24]的研究亦顯示siRNA注射量與目標(biāo)基因抑制率具有顯著量效關(guān)系。因此后續(xù)研究擬設(shè)置更高的慢病毒注射量以獲得更高的抑制效率。其二，本研究使用的是急性期結(jié)腸炎模型，而IBD為慢性疾病，反復(fù)發(fā)作且存在腸道纖維化致腸道功能損害的結(jié)局。后續(xù)應(yīng)設(shè)計慢性結(jié)腸炎動物模型以彌補此缺陷，并進一步探索對腸道纖維化是否具有預(yù)防作用。

綜上所述，本研究在TNBS結(jié)腸炎小鼠模型中證實IL-23 p19 RNA干擾可減輕結(jié)腸炎臨床癥狀，改善組織炎癥活動度，作用機制在于抑制Th17細胞及其效應(yīng)細胞因子IL-17表達，進而減輕黏膜炎癥反應(yīng)。IL-23 p19 RNA干擾治療對IBD的遠期療效還需進一步研究。RNA干擾治療IBD具有廣闊的應(yīng)用前景，盡管臨床前實驗已證實其有效性，但其生物安全性仍存在疑問，距臨床試驗還需經(jīng)歷很長的研究路程。