蔣鼎， 丁道芳， 韓大鵬， 翟偉韜， 歐陽桂林， 薛艷， 薛喬， 曹月龍

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院骨傷研究所，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)學(xué)院，上海 201203；4.上海中醫(yī)藥研究院光華關(guān)節(jié)炎研究所，上海 200052；5.西藏奇正藏藥股份有限公司，西藏 860000）

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，累及關(guān)節(jié)軟骨乃至整個(gè)關(guān)節(jié)，包括軟骨下骨、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周圍肌肉。骨關(guān)節(jié)炎病程所涉及的結(jié)構(gòu)中，究竟是何處最早出現(xiàn)病變并導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的問題一直存在爭(zhēng)議。近年有不少研究[1-4]表明，滑膜炎癥在骨關(guān)節(jié)炎中起到了重要的作用，滑膜炎在不同程度的骨關(guān)節(jié)炎患者中皆存在，包括一些僅有前期癥狀的患者，且滑膜炎與骨關(guān)節(jié)炎患者疼痛程度以及病情進(jìn)展有著密切關(guān)系。根據(jù)不斷出現(xiàn)的新的證據(jù)，有學(xué)者提出滑膜的病變?cè)诠顷P(guān)節(jié)炎中也許是病起源頭而非以往所認(rèn)知的病發(fā)結(jié)果[5]。

奇正白脈軟膏根據(jù)傳統(tǒng)藏醫(yī)理論研制而成，具有舒筋活絡(luò)功效，含姜黃、肉豆蔻、甘松、陽起石、甘草、人工麝香、干姜、藏茴香、藏菖蒲、花椒、堿花等成分，常用于白脈病、癱瘓、偏癱、筋腱強(qiáng)直、外傷引起的經(jīng)絡(luò)及筋腱斷傷、手足攣急、跛行等病癥。既往有研究顯示，白脈軟膏對(duì)骨折愈合、關(guān)節(jié)扭傷、筋膜炎等疾病有肯定的療效[6-9]，但其對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用則需進(jìn)一步研究。探究退變滑膜細(xì)胞對(duì)軟骨細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)變化的影響，有助于了解關(guān)節(jié)炎病程，因此，本研究應(yīng)用滑膜—軟骨共培養(yǎng)體系探討骨關(guān)節(jié)炎病理過程以及白脈軟膏對(duì)其干預(yù)作用，以期為其臨床防治骨關(guān)節(jié)炎提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生SD大鼠8只，體質(zhì)量（200±20）g，雄性，SPF級(jí)，購(gòu)自上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（滬2013-0016）。

1.2主要藥物、試劑與儀器奇正白脈軟膏（西藏奇正藏藥股份有限公司，批號(hào)：151036）；扶他林軟膏（北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：VP0756）。脂多糖（LPS）（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液（100×）、2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化液（法國(guó)Biowest公司）；白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（臺(tái)灣Arigo公司）；PCR試劑盒（美國(guó)Selleck公司）；基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）、磷酸化核因子κBp65（p-NF-κBp65）、Ⅱ型膠原（COL2A1）抗體（美國(guó) MP Biomedicals公司）。SIGMA離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；TDZ4-WS離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific）；IX41顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3白脈軟膏、扶他林軟膏含藥血漿的制備方法給予大鼠背部剃光毛，將藥膏涂于大鼠背部，大鼠每日藥量依據(jù)文獻(xiàn)[10]按照體表面積折算公式進(jìn)行換算：大鼠每日藥量=成人（70 kg）每日藥量×0.018=200 g，每日2次，連續(xù)3 d。第3 d第2次涂完1 h后，按每100 g大鼠體質(zhì)量注射0.15 mL（45 μg/g）的戊巴比妥鈉，深度麻醉后沿腹部正中線打開腹腔，暴露腹主動(dòng)脈；應(yīng)用10 mL一次性注射器緩慢抽吸腹主動(dòng)脈血，轉(zhuǎn)移到15 mL無菌一次性抗凝離心管中室溫靜置2 h，3 000 r/min離心20 min，吸取上層血漿，-80℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.4滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)將8只新生24 h SD大鼠用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡5 min后麻醉處死，取出四肢關(guān)節(jié)處滑膜、軟骨組織。將滑膜組織剔除脂肪、血塊，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次；將標(biāo)本移入另一新的培養(yǎng)皿中，剪碎滑膜組織，大小不超過1 mm3，吸取滑膜組織點(diǎn)狀接種于25 cm2培養(yǎng)瓶底壁，均勻排列，將培養(yǎng)瓶豎立放置；加入5 mL完全培養(yǎng)基，蓋上瓶蓋，豎立放于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，水平放置培養(yǎng)；每3 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞單層長(zhǎng)滿70%～80%后，2.5 g/L胰酶消化，傳代。取3～5代生長(zhǎng)較好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。軟骨組織采用本研究所已成熟的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法[12]，0.1%的Ⅱ型膠原酶消化1 h，重復(fù)3～4次，收集消化的細(xì)胞懸液，1 000 r/min，離心10 min后取細(xì)胞沉淀，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。

1.5 LPS誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞退變及滑膜細(xì)胞形態(tài)觀察打開大鼠膝關(guān)節(jié)腔，取出滑膜組織，Ⅰ型膠原酶消化2～3 h，1 000 r/min離心10 min，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。待細(xì)胞鋪滿皿底，胰酶消化傳代培養(yǎng)，取第1代（P1）細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入LPS（質(zhì)量濃度為1 μg/mL）誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞退變，24 h后在倒置顯微鏡下觀察滑膜細(xì)胞的密度與形態(tài)。

1.6ELISA檢測(cè)滑膜細(xì)胞上清IL-1β、TNF-α表達(dá)分別設(shè)立空白組、模型組、西藥組、白脈組?？瞻捉M：正常滑膜細(xì)胞（無LPS誘導(dǎo)）；模型組：退變滑膜細(xì)胞（LPS誘導(dǎo)）；西藥組：退變滑膜細(xì)胞（LPS誘導(dǎo)）+扶他林軟膏血漿干預(yù)；白脈組：退變滑膜細(xì)胞（LPS誘導(dǎo)）+白脈軟膏血漿干預(yù)。收集各組細(xì)胞上清液，ELISA檢測(cè)IL-1β和TNF-α表達(dá)。具體操作步驟：將樣品和配制好的標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板中，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均做復(fù)孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)1次；36℃溫育1.5 h；Wash Buffer洗滌5次；標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中分別加入抗體結(jié)合物，36℃溫育1 h；重復(fù)洗滌5次；加入鏈酶親和素—HRP，36℃溫育30 min；重復(fù)洗滌5次；加入TMB試劑，36℃避光溫育15 min；加入終止液，終止反應(yīng)（孔中溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色）；立即以450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算出各樣本濃度。

1.7退變滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系及軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察LPS誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞24 h后，撤掉LPS；按常規(guī)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)方法將誘導(dǎo)后的大鼠滑膜細(xì)胞與大鼠軟骨細(xì)胞分別接種于Transwell小室的上室和下室，再于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別設(shè)立空白組、模型組、西藥組、白脈組?？瞻捉M：正?；ぜ?xì)胞（無LPS誘導(dǎo)）+正常軟骨細(xì)胞+正常大鼠血漿干預(yù)；模型組：退變滑膜細(xì)胞（LPS誘導(dǎo)）+正常軟骨細(xì)胞組+正常大鼠血漿干預(yù)；西藥組：退變滑膜細(xì)胞（LPS誘導(dǎo)）+正常軟骨細(xì)胞+西藥（扶他林軟膏）血漿組干預(yù)；白脈組：退變滑膜細(xì)胞（LPS誘導(dǎo)）+正常軟骨細(xì)胞+白脈血漿干預(yù)。培養(yǎng)24 h后，觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)。

1.8實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)共培養(yǎng)體系中MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9基因表達(dá)退變的滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，抽提各組共培養(yǎng)體系中的軟骨細(xì)胞總RNA及濃度測(cè)定，取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參基因，2-△△CT方法可用于定量PCR實(shí)驗(yàn)來計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化（p），見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.9Western blot法檢測(cè)各組共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1的表達(dá)情況首先收集蛋白樣品：原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后裂解細(xì)胞和蛋白濃度測(cè)定，蛋白變性后備用。蛋白樣品電泳和轉(zhuǎn)膜；體積分?jǐn)?shù)10%BSA室溫封閉1 h；一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次10 min；二抗（1∶20 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，X膠片曝光顯影，采用Image J圖像分析管理系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.10統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1退變滑膜培養(yǎng)及指標(biāo)檢測(cè)

2.1.1 滑膜細(xì)胞形態(tài)觀察 培養(yǎng)24 h后，正?；ぜ?xì)胞呈多角形（見圖1-A），經(jīng)LPS誘導(dǎo)后滑膜細(xì)胞形態(tài)明顯變細(xì)長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形（見圖1-B）。

圖1 倒置顯微鏡觀察滑膜細(xì)胞形態(tài)（×100）Figure 1 The morphological features of synoviocytes under inverted microscope（×100）

2.1.2 滑膜細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α含量 表2結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組IL-1β、TNF-α含量均顯著降低（P＜0.05），西藥組僅TNF-α含量降低（P＜0.05）。

表2 各組滑膜細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α含量比較Table 2 Comparison of the contents of IL-1β and TNF-α in the synoviocyte supernatant in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各組滑膜細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α含量比較Table 2 Comparison of the contents of IL-1β and TNF-α in the synoviocyte supernatant in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組西藥組白脈組F P TNF-α 36.645±9.592 62.793±6.716①43.815±4.904②38.787±7.699②5.283 0.015 IL-1β 38.711±6.209 53.055±7.569①46.599±6.369 40.308±3.278②3.256 0.059

2.2共培養(yǎng)體系中退變滑膜細(xì)胞對(duì)軟骨細(xì)胞的影響

2.2.1 共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞形態(tài) 共培養(yǎng)24 h后觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)。圖2結(jié)果顯示：與空白組比較，其余3組細(xì)胞形態(tài)明顯細(xì)長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形改變；與模型組比較，白脈組、西藥組軟骨細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。

2.2.2 共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞基因表達(dá) qPCR法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9 mRNA表達(dá)。圖3結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組軟骨細(xì)胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達(dá)明顯升高，Sox9 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組、西藥組MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達(dá)降低，Sox9 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖2 倒置顯微鏡觀察各組軟骨細(xì)胞形態(tài)（×100）Figure 2 The morphological features of chondrocytes under inverted microscope（×100）

2.2.3 共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞蛋白表達(dá) Western blot法檢測(cè)各組共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1蛋白的表達(dá)情況。圖4結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組MMP13、p-NF-κBp65表達(dá)升高，COL2A1表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組MMP13、p-NF-κBp65表達(dá)降低，COL2A1表達(dá)升高（P＜0.05），西藥組僅COL2A1表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖3 各組軟骨細(xì)胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9 mRNA表達(dá)比較Figure 3 Comparison of the mRNA expression levels of MMP3，TNF-α，ADAMTS4，and Sox9 in the chondrocytes of various groups

3 討論

生理情況下，為維持軟骨結(jié)構(gòu)的完整，內(nèi)環(huán)境中分解性細(xì)胞因子和合成性細(xì)胞因子共同作用，二者在體內(nèi)維持著分解代謝與合成代謝的動(dòng)態(tài)平衡，而滑膜炎癥則打破了內(nèi)環(huán)境的平衡從而導(dǎo)致進(jìn)一步的軟骨侵蝕[13]。骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中的起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α在滑膜及軟骨處皆檢測(cè)出大量表達(dá)[13-15]。諸多證據(jù)[4，5]提示，滑膜炎可能先于關(guān)節(jié)軟骨的破壞，為骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的前驅(qū)，滑膜退變和軟骨退變互相影響形成“滑膜—軟骨”軸，滑膜退變是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要因素。本研究觀察了退變滑膜細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞的形態(tài)、基因表達(dá)的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察了白脈軟膏對(duì)“滑膜—軟骨”軸的干預(yù)作用。

圖4 各組軟骨細(xì)胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1蛋白表達(dá)比較Figure 4 Comparison of the protein expression levels of MMP13，p-NF-κBp65，and COL2A1 in the chondrocytes of various groups

IL-1β和TNF-α是與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)的炎癥指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)明顯的成纖維樣改變，滑膜細(xì)胞上清中IL-1β和TNF-α含量升高，白脈含藥血漿可有效下調(diào)IL-1β和TNF-α含量。表明LPS誘導(dǎo)后加重了滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其形態(tài)變化亦與滑膜細(xì)胞退變進(jìn)程符合，而白脈含藥血漿能抑制滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及退變進(jìn)程。

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及關(guān)節(jié)及周圍組織多種病理改變，這些病變相互影響并促進(jìn)了疾病的發(fā)展，為了研究其病理機(jī)制尚需要提供與體內(nèi)環(huán)境相似的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。細(xì)胞共培養(yǎng)體系可模擬體內(nèi)環(huán)境，常應(yīng)用于骨科相關(guān)病理基礎(chǔ)研究中[17]。軟骨基質(zhì)的主要成分有水、膠原和蛋白多糖。Ⅱ型膠原（COL2A1）是關(guān)節(jié)軟骨的主要結(jié)構(gòu)成分，MMP3與MMP13皆屬于基質(zhì)降解酶，MMP13被證實(shí)為Ⅱ型膠原最有效的降解酶，而IL-1β、TNF-α是軟骨降解的有效激活物[16]。聚蛋白多糖酶家族（ADAMTS）為A-can退變的重要影響因素，ADAMTS4被證實(shí)與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展密切相關(guān)[18]。Sox9基因能調(diào)控軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多聚糖的表達(dá)，抑制軟骨降解的作用[19]。NF-κB是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，其在骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)及疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，與軟骨降解和關(guān)節(jié)損傷密切相關(guān)[20，21]。退變滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞逐漸細(xì)長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形改變。軟骨細(xì)胞失去原有形態(tài)特征，這與骨關(guān)節(jié)炎病程中關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生成纖維化與肥大化改變一致。與模型組比較，西藥組、白脈組軟骨細(xì)胞的形態(tài)無明顯差異。提示軟骨細(xì)胞與退變滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)生退變，扶他林軟膏、白脈軟膏含藥血漿對(duì)此形態(tài)變化未顯示出明顯的抑制作用。PCR結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組軟骨細(xì)胞MMP3、ADAMTS4、TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)，Sox9mRNA表達(dá)下調(diào)；與模型組比較，白脈組軟骨細(xì)胞明顯抑制MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達(dá)，并上調(diào)Sox9 mRNA表達(dá)。說明退變滑膜細(xì)胞促進(jìn)了軟骨細(xì)胞退變，加重了骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)展，提示“滑膜—軟骨”軸對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起促進(jìn)作用，而白脈含藥血漿對(duì)此病理過程有明顯抑制作用。Western blot結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組MMP13、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)上調(diào)，明顯抑制COL2A1蛋白表達(dá)；與模型組比較，白脈組MMP13、p-NF-κBp65表達(dá)上調(diào)，COL2A1表達(dá)下調(diào)。表明白脈軟膏含藥血漿可能通過抑制p-NF-κBp65表達(dá)，減輕骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)，調(diào)控“滑膜—軟骨”軸，從而抑制軟骨破壞。提示白脈軟膏有明顯的軟骨保護(hù)作用，對(duì)“滑膜—軟骨”軸起抑制作用。

從白脈軟膏配方組成來看，姜黃破血行氣、通經(jīng)止痛，肉豆蔻溫中止痛，甘松行氣止痛，麝香活血止痛，干姜、茴香散寒止痛，藏菖蒲散熱消腫，花椒散寒祛痹，陽起石補(bǔ)虛祛痹，甘草調(diào)和諸藥、緩急止痛。諸藥合制，共奏活血止痛、舒筋消腫之效。其舒筋活絡(luò)止痛的功效亦與骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)臨床治療相對(duì)應(yīng)。

綜上所述，“滑膜—軟骨”軸中滑膜細(xì)胞的變化在滑膜病變中起著重要作用，其退變可影響軟骨細(xì)胞形態(tài)及基因表達(dá)，滑膜的退變可促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。白脈軟膏對(duì)“滑膜—軟骨”軸有著明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能與減輕滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制軟骨細(xì)胞NF-κB活化，降低“滑膜—軟骨”軸中各降解性細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。