駢亞亞，陶鳳蓉，馮敏，聶晶晶，高振祥，胡繼紅

1.北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學(xué)中心 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 老年醫(yī)學(xué)研究院；2.北京醫(yī)院 檢驗科 國家老年醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 老年醫(yī)學(xué)研究院；3.北京醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科 國家老年醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 老年醫(yī)學(xué)研究院；北京100730

淋巴細(xì)胞是機體參與正常免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞，其發(fā)育成熟后向二級淋巴組織進(jìn)行遷移。高內(nèi)皮細(xì)胞小靜脈（high endothelial venule，HEV）是存在于淋巴結(jié)等二級淋巴器官（除脾臟）的后毛細(xì)靜脈，是淋巴細(xì)胞遷移的重要通道[1-2]。當(dāng)初始淋巴細(xì)胞遇到特異性抗原或有炎癥刺激時，會穿過血管內(nèi)皮迅速遷移至感染部位行駛其免疫功能[3]。研究表明，淋巴細(xì)胞的大量浸潤在某些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，明確其機理對于疾病的防治有重要意義。

淋巴細(xì)胞遷移是一個非常復(fù)雜的過程，涉及到淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。淋巴細(xì)胞通過自身受體L-selectin、PSDL-1、MadCAM-1與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面配體PNAd、P-selectin、E-selec?tin、MadCAM-1 結(jié)合后被內(nèi)皮細(xì)胞捕獲[4-5]，隨后，淋巴細(xì)胞通過整合素受體或白細(xì)胞功能相關(guān)抗原與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1 結(jié)合，從而啟動鈣離子信號通路，肌動蛋白微絲收縮，血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接破壞，淋巴細(xì)胞隨之遷移[5-6]。在趨化因子CCL19、CCL21的趨化作用下，淋巴細(xì)胞跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)各個組織，行使其免疫監(jiān)視和免疫保護(hù)功能。

我們前期篩選出一些在小鼠胰島血管內(nèi)皮細(xì)胞MS1 上高表達(dá)的基因，比如毛狀樣蛋白1（co?actosin-like protein-1，Cotl1）基因，這些基因可能影響淋巴細(xì)胞的遷移。據(jù)報道，Cotl1 對小鼠新皮層神經(jīng)元的遷移產(chǎn)生一定的影響[7]，Cotl1在小鼠皮質(zhì)發(fā)生過程中抑制神經(jīng)元遷移[8]，而Cotl1在淋巴細(xì)胞遷移中的機制沒有報道。因此，我們在此擬探討炎癥條件下Cotl1 調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的遷移，該研究對于深入理解淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞向外周淋巴結(jié)遷移具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠胰島血管內(nèi)皮細(xì)胞MS1、大腸桿菌DH5α、敲除質(zhì)粒puro_Cas9_empty 由本室保存；引物合成及測序由Invitrogen 公司完成[sgRNA 引物為Cotl1-F（5'-CACCGTCTCTCCGAGGACCTTAGC T-3'）和Cotl1-R（5'-AAACGGTGCCCACCCTCTTT CAAAA-3'），ICAM1、VCAM1、P-selectin RT-PCR引物為本室保存]。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購自Hyclone 公司；LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑、嘌呤霉素購自Invitrogen 公司；BsmBⅠ內(nèi)切酶、DTT 購自Thermo Scientific 公司；LPS、CCL19 購自Peprotech 公 司；流 式 抗 體購 自eBioscience 公司；RNA 提取試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司；TaqDNA 聚合酶、實時定量PCR SYBR Premix ExTaq、T4DNA 連接酶購自大連寶生物工程有限公司；氨芐青霉素購自Sig?ma 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；基因組提取試劑盒購自北京天為時代生物科技有限公司；Transwell 小室（5 μm）、細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板購自Corning 公司；實時熒光定量PCR 儀ABI 7500 購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；流式細(xì)胞儀BD LSRFort?essa 購 自 美國BD 公 司。

1.2 敲除載體的構(gòu)建

利用在線網(wǎng)站http://crispr.mit.edu 設(shè)計sgRNA引物并構(gòu)建敲除載體，通過核酸電泳及測序進(jìn)行驗證。

1.3 敲除細(xì)胞系的篩選及鑒定

鋪5×104MS1細(xì)胞于6 孔板，過夜培養(yǎng)直至細(xì)胞密度達(dá)到60%左右即可用于轉(zhuǎn)染。將1～2 μg 敲除質(zhì)粒用LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染，其中不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的孔為空白對照；用終濃度為2.5 μg/mL的嘌呤霉素篩選72 h，直至空白對照細(xì)胞全部被殺死；胰酶消化剩余細(xì)胞，計數(shù)并將30～50個細(xì)胞接種至96 孔板，以確保能篩選到單個細(xì)胞；單個細(xì)胞經(jīng)1周培養(yǎng)后，剔除有2個細(xì)胞以上的孔，轉(zhuǎn)移至48 孔板擴大培養(yǎng)，然后接著6 孔板培養(yǎng)直至長滿單層細(xì)胞；提取基因組并PCR 測序，將正確的敲除細(xì)胞系于液氮中保存。

1.4 淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附實驗

5×104細(xì)胞鋪于48 孔板直至長成單細(xì)胞層；DMEM 洗2 次，并加終濃度 為10 ng/mL的LPS 刺激過夜；DMEM 洗2 次，取野生小鼠腹股溝和腋窩淋巴結(jié)，研磨、計數(shù)，按內(nèi)皮細(xì)胞∶淋巴細(xì)胞為1∶8的比例進(jìn)行黏附實驗，時間為24 h；DMEM 洗5次，胰酶消化后流式細(xì)胞術(shù)分析，根據(jù)細(xì)胞大小區(qū)分內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，并統(tǒng)計淋巴細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。

1.5 血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子檢測實驗

RT-PCR和流式抗體檢測MS1細(xì)胞和敲除細(xì)胞Cotl1-/-表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin的表達(dá)情況，其中LPS的用量為0、2.5、5和10 ng/mL。LPS 作用24 h后，處理細(xì)胞并進(jìn)行RT-PCR，HPRT 為內(nèi)參；或染色I(xiàn)CAM1、VCAM1、P-selectin抗體進(jìn)行流式實驗。

1.6 Transwell 實驗

5 μm Transwell 小室用于淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞遷移模型。MS1細(xì)胞和敲除細(xì)胞Cotl1-/-重懸至4.5×105/mL，取100 μL細(xì)胞加到Transwell 小室上層，600 μL DMEM 加到小室下層，培養(yǎng)至單分子細(xì)胞層；DMEM 洗2 次，然后在小室上方加入終濃度10 ng/mL的LPS 刺激過夜，小室下方換成新鮮DMEM 培養(yǎng)基；DMEM 洗2 次，取野生小鼠腹股溝和腋窩淋巴結(jié)，研磨、計數(shù)，按內(nèi)皮細(xì)胞∶淋巴細(xì)胞為1∶8的比例進(jìn)行遷移實驗，即在小室上方加100 μL 5×106/mL 淋巴細(xì)胞，下方加600 μL 終濃度為10 ng/mL的趨化因子CCL19，作用24 h，收集淋巴細(xì)胞，流式染色并上機分析。

2 結(jié)果

2.1 敲除細(xì)胞Cotl1-/-的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

利用CRISPR/Cas9 敲除小鼠胰島血管內(nèi)皮細(xì)胞MS1的Cotl1基因。圖1 為PCR 電泳圖，挑取23個克隆均為陽性，最后一個為空白質(zhì)粒。測序結(jié)果證明敲除細(xì)胞株Cotl1-/-構(gòu)建成功。

2.2 淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附結(jié)果

淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附結(jié)果見圖2，在LPS 刺激下，淋巴細(xì)胞黏附MS1細(xì)胞的比例顯著高于敲除細(xì)胞Cotl1-/-。在LPS 刺激下，淋巴細(xì)胞與MS1細(xì)胞的黏附顯著高于敲除細(xì)胞Cotl1-/-，且隨著LPS 濃度升高黏附值越高。該結(jié)果證明在炎癥條件下Cotl1基因可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。

2.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)情況

分別采用RT-PCR和流式方法檢測了MS1細(xì)胞和敲除細(xì)胞Cotl1-/-在LPS 刺激下黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3。在LPS 刺激下，ICAM1、VCAM1、P-selectin的表達(dá)量均顯著升高，且MS1細(xì)胞表達(dá)的ICAM1、VCAM1、P-selectin 要顯著高于敲除細(xì)胞Cotl1-/-，證明在炎癥條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞MS1表面的黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 上調(diào)表達(dá)。

圖1 敲除細(xì)胞系Cotl1-/-的菌落PCR 鑒定

2.4 淋巴細(xì)胞跨血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移結(jié)果

用Transwell 方法比較了在LPS 刺激下淋巴細(xì)胞及亞群穿過MS1細(xì)胞和敲除細(xì)胞Cotl1-/-的差異，結(jié)果如圖4。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)總淋巴細(xì)胞穿過MS1細(xì)胞的比例顯著高于敲除細(xì)胞Cotl1-/-，說明Cotl1基因缺失嚴(yán)重影響了淋巴細(xì)胞的跨血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。我們同時分析了淋巴細(xì)胞不同亞群穿過MS1細(xì)胞和敲除細(xì)胞Cotl1-/-的遷移情況，發(fā)現(xiàn)CD4和CD8 T細(xì)胞穿過MS1細(xì)胞的比例顯著高于敲除細(xì)胞Cotl1-/-，而B細(xì)胞無顯著差異，說明CD4和CD8 T細(xì)胞的跨血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移受到Cotl1基因的影響。

圖2 淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附結(jié)果比較

圖3 內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的檢測

圖4 淋巴細(xì)胞及其亞群穿過MS1細(xì)胞和敲除細(xì)胞Cotl1-/-的百分比比較

3 討論

淋巴細(xì)胞是機體參與正常免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的重要功能細(xì)胞，而血管內(nèi)皮細(xì)胞是調(diào)控淋巴細(xì)胞遷入和遷出的重要基質(zhì)細(xì)胞，是通過表達(dá)一系列選擇素配體、黏附分子和趨化因子來進(jìn)行調(diào)節(jié)的。研究表明，向淋巴結(jié)遷入的T細(xì)胞高表達(dá)L-selectin，而外周淋巴結(jié)的高內(nèi)皮細(xì)胞則高表達(dá)L-selectin的配體PNAd（peripheral node ad?dressin）。PNAd 是一系列能和L-selectin 結(jié)合的硫化、糖基化和唾液酸化的唾液黏蛋白，包括Gly?CAM、CD34、sgp200 等。在腸系膜淋巴結(jié)及派爾結(jié)內(nèi)的高內(nèi)皮細(xì)胞上，則高表達(dá)L-selectin 另一配體MadCAM-1[9]。P-selectin和E-selectin 也參與T細(xì)胞的黏附和遷移，其中E-selectin 可介導(dǎo)記憶性CD4+T細(xì)胞與活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。此外，T細(xì)胞表面的CCR7與HEV 介導(dǎo)的趨化因子CCL19 或CCL21 接觸，使LFA-1 發(fā)生外翻，隨即與黏附分子ICAM-1、ICAM-2 或VCAM-1 緊密結(jié)合，T細(xì)胞 被緊 緊 吸附在HEV 上[1]。

淋巴細(xì)胞跨血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移主要取決于與高內(nèi)皮細(xì)胞微靜脈的相互作用。我們前期通過RNA-seq 方法篩選到一些在小鼠胰島血管內(nèi)皮細(xì)胞MS1 上高表達(dá)的基因，如Cotl1基因，但關(guān)于Cotl1 是否影響淋巴細(xì)胞的遷移目前尚無文獻(xiàn)報道。因此，本研究探討了炎癥條件下Cotl1 調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的遷移。主要研究方法是通過CRISPR/Cas9 技術(shù)在體外構(gòu)建敲除細(xì)胞株Cotl1，然后通過細(xì)胞黏附和Transwell 實驗來探究Cotl1基因如何調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞跨血管內(nèi)皮細(xì)胞的分子機制。PCR及測序結(jié)果證明敲除細(xì)胞株Cotl1-/-構(gòu)建成功。黏附實驗證明，在LPS 刺激下淋巴細(xì)胞對MS1細(xì)胞的黏附能力顯著高于敲除細(xì)胞Cotl1-/-，說明Cotl1基因能促進(jìn)淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。那么這種黏附的分子作用機制又是如何？細(xì)胞之間的黏附主要是通過表達(dá)各種黏附分子起作用的，主要的黏附分子包括ICAM1、VCAM1、P-se?lectin 等，于是我們檢測了MS1細(xì)胞和敲除細(xì)胞Cotl1-/-表面黏附分子的表達(dá)，結(jié)果證實，無論在RNA 還是蛋白水平，在LPS 刺激下MS1細(xì)胞表面黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin表達(dá)量顯著高于敲除細(xì)胞Cotl1-/-，證明黏附分子ICAM1、VCAM1、P-selectin 參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的黏附過程。黏附是遷移的第一步，亦是關(guān)鍵一步，但黏附不一定發(fā)生遷移，因此，我們用Tran?swell 模型比較了淋巴細(xì)胞及其亞群穿過MS1細(xì)胞和敲除細(xì)胞Cotl1-/-的遷移能力，發(fā)現(xiàn)在LPS 刺激下淋巴細(xì)胞及其亞群（除B細(xì)胞外）穿過MS1細(xì)胞的能力略高于敲除細(xì)胞Cotl1-/-，證明Cotl1基因可能影響到淋巴細(xì)胞的跨血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。

目前我們對于淋巴細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的認(rèn)識還太少，因此，本研究不僅可以進(jìn)一步加深對淋巴細(xì)胞遷移和免疫應(yīng)答機制的理解，同時對淋巴細(xì)胞應(yīng)答的免疫調(diào)控和臨床應(yīng)用也具有一定的指導(dǎo)意義。