韓慧，李敏，楊曉嵐，段躍強(qiáng)，谷宏婧，范鐵炯，李鑫，楊鵬輝，劉媛，閆芳，鄭源強(qiáng)，石艷春，趙忠鵬

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010058；2.病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所，北京100071；3.上海賽倫生物技術(shù)股份有限公司，上海 201707；4.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心，北京100039；5.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷030800

金黃色葡萄球菌是引起人類感染和細(xì)菌性食物中毒的一種重要致病菌，在自然界中分布廣泛[1]。在歐美各國、日本、東南亞國家及我國，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒時有發(fā)生。歷年的食物中毒調(diào)查表明，由該菌引起的食物中毒事件排在整個細(xì)菌性食物中毒的前兩位[2]。

金黃色葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal en?terotoxin B，SEB）是由金黃色葡萄球菌分泌的一種外毒素，可溶，耐熱，不受胰蛋白酶影響[3]。一般情況下，SEB 刺激嘔吐中樞會導(dǎo)致以嘔吐為主要癥狀的食物中毒，并且SEB 結(jié)合于腸壁上皮細(xì)胞的受體，促進(jìn)腸液與氯離子分泌，引起腹瀉癥狀。另外，SEB 是一種細(xì)菌超抗原，非特異性地激活T細(xì)胞，并因釋放過量細(xì)胞因子，產(chǎn)生毒副作用而致病，能引起人嘔吐、腹瀉、腹痛甚至致死性休克等中毒癥狀[4]。

目前，我國對SEB 中毒尚無有效防治藥品，只能對癥治療。因此，研制SEB 救治藥物是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。鑒于SEB 至今沒有有效的解毒劑，憑借歷史上解毒藥物開發(fā)的經(jīng)驗(yàn)，利用當(dāng)代馬抗生產(chǎn)技術(shù)研制SEB 治療性抗體，是非常有價值的一種探索[7]。

在本研究中，我們利用成熟的治療性馬抗生物制品制備技術(shù)平臺，研制出馬抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2制品，為SEB 中毒的應(yīng)急救治提供了候選藥。

1 材料和方法

1.1 材料

體質(zhì)健康蒙古馬，4～6歲，10 匹，購自赤峰博恩藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢疫符合現(xiàn)行《中國藥典》要求；SPF 級BALB/c 小鼠，6～8周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)SEB 重組菌株，實(shí)驗(yàn)室自制；產(chǎn)SEB 野生菌株，購自中國食品藥品研究院標(biāo)準(zhǔn)品中心。

1.2 重組SEB 免疫原的制備及檢定

挑取內(nèi)含pGEM-7Zf-SEB 質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α單菌落于新鮮培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液D600nm值達(dá)0.6～0.8 時，加入1.0 mmol/L的IPTG，于32℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h，離心得菌體，用0.1 mmol/L的Tris-HCl溶解，超聲波破碎，離心去菌體，取上清；將固體硫酸銨加入收集的上清液中，使其飽和度達(dá)45%，4℃放置5 h，12 000 r/min 離心10 min，收集上清后繼續(xù)加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)75%，4℃放置5 h，12 000 r/min 離心10 min，取沉淀；將沉淀蛋白溶解于1 mol/L 硫酸銨溶液中，調(diào)蛋白濃度；將兩疏水柱Pheny l FF和Pheny l HP 串聯(lián)后用1 mol/L的硫酸銨平衡，再將樣品以1 mL/min的流速過此串聯(lián)疏水柱，收集穿透液；穿透液經(jīng)過夜透析后，以5 mL/min的流速上已平衡的SP陽離子柱，待紫外吸收值回到基線后進(jìn)行線性梯度洗脫，收集蛋白峰；經(jīng)SDS-PAGE和HPLC 測定重組SEB 蛋白純度；在腹腔注射50 μg/kg LPS 激發(fā)下，通過腹腔注射重組SEB 蛋白攻擊小鼠測定重組SEB 半數(shù)致死量（LD50）。

1.3 天然SEB 樣品的制備及檢定

挑取產(chǎn)B 型腸毒素的金黃色葡萄球菌單菌落于Dolman 培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)后，以1%的接種量均勻鋪于覆蓋滅菌玻璃紙的新鮮Dolman 固體培養(yǎng)基平板表面，37℃孵育48 h，用無菌生理鹽水收獲刮洗菌苔，12 000 r/min 離心15 min，取上清用聚乙二醇8000 濃縮至1/30，置截留量5kD的透析袋中，在4℃條件下充分透析平衡；取平衡透析液至陽離子交換柱CM-32，依次以不同離子強(qiáng)度緩沖液進(jìn)行階段洗脫，收集洗脫峰，充分透析平衡；取一定量粗純平衡液上樣至平衡過夜的凝膠過濾柱Sephadex G-75，洗脫，收集第二個洗脫峰，對蒸餾水充分透析脫鹽，真空冷凍干燥，即為純化的天然SEB，4℃保存；用SDS-PAGE和HPLC 測定純化后天然SEB的純度，在腹腔注射50 μg/kg LPS 激發(fā)下，通過腹腔注射攻擊小鼠測定天然SEB的LD50。

1.4 馬抗SEB 原料血漿的制備

重組SEB 加入不完全弗氏佐劑乳化制備免疫原，采用皮下、肌肉、腹股溝淋巴結(jié)多點(diǎn)免疫經(jīng)檢驗(yàn)合格的馬匹，間隔21 d，免疫4 次，免疫劑量分別為2、4、8、16 mg。當(dāng)免疫動物ELISA 效價不低于2000 U/mL 時采集血漿，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 馬抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2成品制備及檢定

在上海賽倫生物技術(shù)有限公司GMP 廠房，按照我們建立的馬抗免疫球蛋白F（ab'）2生產(chǎn)工藝進(jìn)行，制備馬抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2成品[8]。按照建立的制品質(zhì)量規(guī)程測定馬抗SEB 免疫球蛋白成品F（ab'）2各項(xiàng)指標(biāo)，合格的產(chǎn)品命名為SEB 精制免疫球蛋白。

1.6 動物法測定SEB 精制免疫球蛋白對天然SEB的中和效果

選用 小鼠45只，5只/組，共9 組。用0.01 mol/L PBS 分別將SEB 精制免疫球蛋白稀釋至58.0、67.6、77.2、87.0、96.6、106.2、116.0、125.6 μg/0.2 mL 為實(shí)驗(yàn)組，并用0.01 mol/L PBS 將正常馬免疫球蛋白稀釋至125.6 μg/0.2 mL 為對照組。將實(shí)驗(yàn)組、對照組各劑量組加入等體積用0.01 mol/L PBS 配制的5 μg/0.2 mL（10 LD50）天然SEB混勻，37℃放置1 h。將中和后的各組混合液分別腹腔注射小鼠0.4 mL/只，4 h后各組小鼠再腹腔注射用0.01 mol/L PBS 配制的LPS 50 μg/kg（0.2 mL），連續(xù)7 d 觀察小鼠的存活情況，記錄存活率。以小鼠體內(nèi)中和抗體活性作為SEB 精制免疫球蛋白中和抗體效價換算活性單位，以在小鼠體內(nèi)中和1 LD50的天然SEB 蛋白所需SEB 精制免疫球蛋白的量為1個用藥單位（U）。

1.7 SEB 精制免疫球蛋白制品在動物體內(nèi)有效性研究

1.7.1 動物法測定天然SEB 合用LPS 對小鼠致病性LD50取 小 鼠35只，分 為7 組，5只/組。用0.01 mol/L PBS 稀 釋 天 然SEB 為0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5 μg/0.2 mL 6個劑量組，腹腔注射小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，以0.2 mL 0.01 mol/L PBS 腹腔注射小鼠為對照組，4 h后各劑量組每只小鼠再腹腔注射LPS 50 μg/kg（0.2 mL），連續(xù)觀察7 d 并記錄小鼠的存活率。根據(jù)Reed-Muench 公式計算天然SEB 合用LPS 對小鼠致病性LD50。

1.7.2 小鼠體內(nèi)治療試驗(yàn) 選用小鼠25只，分為5 組，5只/組。用0.01 mol/L PBS 將天然SEB 稀釋至5 μg/0.2 mL（10 LD50），每只小鼠腹腔注射，隨后分別于0、1、2、3 h 每只小鼠靜脈注射用0.01 mol/L PBS 稀釋至570 μg/0.2 mL的制品，4 h后每只小鼠腹腔注射LPS 50 μg/kg（0.2 mL），以0.2 mL 0.01 mol/L PBS在0 h后肌肉注射小鼠作為對照，觀察小鼠的存活情況，并記錄存活率。

1.8 安全性檢測

按照現(xiàn)行《中國藥典》要求，對制品進(jìn)行無菌試驗(yàn)、熱原檢查、異常毒性試驗(yàn)、一般藥理試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、免疫毒性試驗(yàn)、溶血和血管刺激性試驗(yàn)[7-8]。

2 結(jié)果

2.1 重組SEB 純品的制備及檢定

對制備的重組SEB 純品進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1，經(jīng)初步優(yōu)化后，純化的重組SEB 純度在90%以上，腹腔注射對小鼠的LD50約為50 μg/kg。

2.2 天然SEB 純品的制備及檢定

對制備的天然SEB 純品進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2，經(jīng)初步優(yōu)化后，純化的天然SEB 純度在90%以上，腹腔注射對小鼠的LD50約為0.5 μg/kg。

2.3 SEB 精制免疫球蛋白的純度

對制備的成品進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3，純化的成品F（ab'）2純度在80%以上。

2.4 動物法測定SEB 精制免疫球蛋白對天然SEB的中和抗體效價

圖1 重組SEB檢測結(jié)果

研制的SEB 精制免疫球蛋白（表1）在4 μL（116.0 μg）以上時小鼠能夠完全存活，而正常馬免疫球蛋白對照組小鼠全部死亡，表明研制的SEB 精制免疫球蛋白具有很好的中和SEB 中毒的作用。以在小鼠體內(nèi)中和1 LD50的天然SEB 蛋白所需SEB 精制免疫球蛋白的量為1 U，則每1 mL（28.5 mg）SEB 精制免疫球蛋白活性為2500 U。

2.5 SEB 精制免疫球蛋白小鼠體內(nèi)救治效果

圖2 天然SEB檢測結(jié)果

圖3 SEB 精制免疫球蛋白成品檢定結(jié)果

表1 SEB精制免疫球蛋白對10 LD50天然SEB致小鼠模型的中和抗體活性

各時間點(diǎn)注射SEB 精制免疫球蛋白（表2）的小鼠全部存活，小鼠給藥后體重雖有下降，但于給藥后的第3 d 均恢復(fù)至注射天然SEB 毒素前的體重，而沒有用SEB 精制免疫球蛋白對照組小鼠則48 h 內(nèi)全部死亡。由此可見，研制的SEB 精制免疫球蛋白在小鼠體內(nèi)具有很好的治療作用。

2.6 SEB 精制免疫球蛋白的安全性

按照現(xiàn)行《中國藥典》要求，委托北京昭衍新藥研究中心，開展了無菌試驗(yàn)、熱原檢查、異常毒性試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、免疫毒性試驗(yàn)、溶血和血管刺激性試驗(yàn)，結(jié)果見表3，均符合現(xiàn)行《中國藥典》要求，具有良好的安全性。

3 討論

金黃色葡萄球菌引起人類化膿性感染、創(chuàng)傷后膿毒敗血癥、食物中毒等不同綜合征，引起動物乳房炎、腹瀉、化膿等疾病。在后抗生素時代，臨床耐藥金黃色葡萄球菌的防治日益嚴(yán)峻[9]。SEB 作為一種外毒素，是金黃色葡萄球菌致病的關(guān)鍵因子之一，是造成嘔吐、腹瀉、腹痛、休克的核心因素，自身可成為失能性生物武器[10]。因此，金黃色葡萄球菌及SEB 防治研究迫在眉睫。

表2 SEB精制免疫球蛋白在小鼠體內(nèi)的治療效果

表3 SEB精制免疫球蛋白成品安全性檢定結(jié)果

SEB 預(yù)防性疫苗在美國已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，安全、有效[11]，在中國還未見報道。目前，我國陸軍軍醫(yī)大學(xué)團(tuán)隊的金黃色葡萄球菌疫苗已進(jìn)入臨床研究階段，其中就含有SEB 關(guān)鍵抗原成分[12]。雖然已有報道SEB 中和性單抗、拮抗劑，但均處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。鑒于對SEB 中毒至今沒有有效的防治手段，憑借毒素抗血清研發(fā)歷史經(jīng)驗(yàn)，利用當(dāng)代馬抗生產(chǎn)技術(shù)研制SEB 治療性抗體，是很有前景的一種手段。

馬抗血清制品歷史悠久，尤其新一代高純度F（ab'）2抗體仍具有頑強(qiáng)的生命力[13]。本研究研發(fā)的SEB 精制免疫球蛋白，從檢測結(jié)果看，安全、有效、穩(wěn)定，有望為SEB 中毒提供應(yīng)急救治措施，目前已進(jìn)入臨床研究階段。

治療性馬抗研發(fā)最核心的環(huán)節(jié)之一是制備免疫原。我們根據(jù)SEB的性質(zhì)，借鑒現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，工程性表達(dá)、純化重組SEB，獲得了純度90%以上的純品，在保存免疫原性的基礎(chǔ)上，大幅度降低了SEB 毒性，為免疫動物用抗原提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。

抗體研發(fā)最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一是治療性抗體的評價。本研究提純了天然SEB 并建立了SEB 中毒細(xì)胞和小、中型動物模型[15]。在3個模型中，我們均證明了制品的有效性，為臨床試驗(yàn)奠定了藥理學(xué)基礎(chǔ)，也為藥效學(xué)評價中細(xì)胞替代動物的研究奠定了基礎(chǔ)。細(xì)胞模型是利用SEB 超抗原的特性，能非特異性刺激細(xì)胞增殖，抗體中和后，細(xì)胞增殖減少（數(shù)據(jù)未給出）；小鼠動物模型是利用LPS 激活機(jī)體條件下，SEB 致小鼠發(fā)生腹瀉等嚴(yán)重脫水癥狀，最終導(dǎo)致死亡；猴子動物模型是利用SEB 致腹瀉、中毒等癥狀，最終導(dǎo)致瀕死（數(shù)據(jù)未給出）。考慮到成本和便于試驗(yàn)數(shù)據(jù)從實(shí)驗(yàn)室過渡到臨床，課題組最終以小鼠動物模型為主，進(jìn)行了SEB 精制免疫球蛋白藥效學(xué)評價，為臨床研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

總之，利用現(xiàn)代生物制藥技術(shù)，我們制備了SEB 精制免疫球蛋白，有望成為SEB 中毒的候選藥，也為SEB 防治產(chǎn)品的升級換代提供了理論和技術(shù)支持。