蔣吉鋒，甘子松，黃技勝，呂慧琪，黃鎖義，韋嘉琦

(1.右江民族醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院 藥學院，廣西 百色 533000；3.右江民族醫(yī)學院 廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室，廣西 百色 533000；4.右江民族醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院，廣西 百色 533000)

楊桃(AverrhoacaramholaL.)又名三廉、陽桃、五棱子、五斂子等，為酢漿草五斂子屬熱帶常綠喬木的果實。楊桃有清熱解毒、生津止渴、利尿通淋的功效，適宜于風熱咳嗽，咽疼牙痛，煩渴，石淋，酒毒者食用[1]，有較高的藥物作用。研究顯示，楊桃中含豐富的糖類、揮發(fā)油、胡蘿卜素、糖類、有機酸和維生素B、C，以及黃酮類化合物等成分[2]。近年已經(jīng)有很多學者對揮發(fā)油的抗炎鎮(zhèn)痛作用進行過研究[3]，同時也有認為有機酸有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗痛風等綜合作用[4]，更重要的是不僅國內(nèi)有學者認為黃酮類化合物在抗炎鎮(zhèn)痛上有重要效果[5]，國外也有類似報道[6]，故推測楊桃可能具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用，但筆者尚未查找到對楊桃抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究報道。另外,國內(nèi)外的專家學者們以小鼠為模型進行了大量的抗炎鎮(zhèn)痛研究，其主要致力于找尋更有效的抗炎鎮(zhèn)痛藥物，改善治療方式，這為我們試驗方法的設計提供參考依據(jù)。如華陀豆不同提取物抗炎鎮(zhèn)痛的實驗研究[7]、濕生扁蕾對小鼠抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[8]。但關(guān)于楊桃對小鼠抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用的研究尚未見報道。因此，本試驗探究楊桃水提物對小鼠抗炎鎮(zhèn)痛的作用，進一步探究楊桃潛在的藥用價值。

1 材料

1.1 藥品

楊桃購自廣西玉林市博白縣東城市場，經(jīng)右江民族醫(yī)學院中藥學教研室周世友副主任藥師鑒定為酢漿草五斂子屬熱帶常綠喬木的果實。陽性對照藥為阿司匹林片，云南白藥集團股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：ZKA1601。

1.2 動物

昆明種小鼠(清潔級)，足齡，體質(zhì)量(20±2) g，由右江民族醫(yī)學院實驗動物研究中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK桂2017-0003，使用許可證：SCXK桂2017-0004。動物喂標準顆粒飼料，自由飲水和攝食，按性別分籠。

1.3 儀器與試劑

DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，DF-15臺式連續(xù)投料粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，TWCL-T5000磁力攪拌電熱套(上海標和儀器有限公司)，RE 3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，F(xiàn)A1204B電子天平(上海天美天平儀器有限公司)，YLS-6B智能熱板儀 (上海精密儀器儀表有限公司)，二甲苯、冰醋酸均為分析純，由天津化工試劑廠提供。水為蒸餾水。

2 方法

2.1 楊桃水提物提取工藝

將新鮮楊桃烘干稱量，粉碎成粗粉，蒸餾水浸泡6 h，置圓底燒瓶內(nèi)，用KDM型調(diào)溫加熱套加熱，揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油和芳香成分后，轉(zhuǎn)為50℃浸煎0.5 h提取水溶性成分，紗布過濾取汁后，藥渣加水再煮沸，轉(zhuǎn)為 50 ℃浸煎，共煎3次。藥液混合，加熱濃縮定容，終濃度為1.0 g/mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠分組

將90只小鼠采用完全隨機設計分組法分成3組：空白對照組(Blank control group, BCG)，阿司匹林組(Aspirin group, AG)及楊桃水提物組(AverrhoacaramholaL. water extract group, AWEG)，每組30只。分別進行抗炎和鎮(zhèn)痛系列試驗共3種，每種試驗各組取10只小鼠。其中楊桃水提物組分別給予楊桃水提取液灌胃，阿司匹林組給予阿司匹林(0.20 g/kg)灌胃，空白對照組給予相同體積蒸餾水灌胃，均每天1次，連續(xù)給藥7 d。以備進一步用各種方法觀察其抗炎、鎮(zhèn)痛反應。

2.3 抗炎作用

2.3.1 蛋清致小鼠足跖腫脹實驗

取小鼠30只，雌雄各半，采用完全隨機設計分組法分為3組，每組10只。給藥組灌胃給予楊桃水提物10.00 g/kg、陽性藥組灌胃給予阿司匹林0.20 g/kg、空白對照組灌20 mL/kg蒸餾水。連續(xù)灌胃給予相應藥物6 d，第7天每只小鼠后右足足墊皮下注射蛋清30 μL致炎，并于致炎后再灌胃給予相應藥物1次，3 h后處死小鼠，剪取雙后足，用分析天平精確稱量，以右足的重量減去左足的重量作為足跖炎性腫脹度，計算小鼠足跖腫脹度(The weight of paw swelling, WOPS)及腫脹抑制率[9](The rate of swelling inhibited, ROSI)。

腫脹度=右后足跖質(zhì)量-左后足跖質(zhì)量

腫脹抑制率=(空白對照組足跖腫脹度-用藥

組足跖腫脹度)/空白對照組足跖腫脹度×100%

2.3.2 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗

取小鼠30只，雌雄各半，采用完全隨機設計分組法分為3組，每組10只。給藥組灌胃給予楊桃水提物10.00 g/kg、陽性藥組灌胃給予阿司匹林0.20 g/kg、空白對照組灌20 ml/kg蒸餾水。均每日1次,連續(xù)給藥7 d。末次給藥0.5 h后，用二甲苯50 μL涂于小鼠右耳廓的正反面，左耳廓作為對照，0.5 h后剪下兩耳，用直徑6 mm的打孔器在兩耳相同部位打下耳片，精密稱量，以右耳的質(zhì)量減去左耳的質(zhì)量作為耳廓炎性腫脹度，計算小鼠耳腫脹度(The weight of auricle tumefaction, WOAT)及腫脹抑制率[10](The rate of tumefaction inhibited, ROTI)。

腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量

腫脹抑制率=(空白對照組耳腫脹度-用藥

組耳腫脹度)/空白對照組耳腫脹度×100%

2.4 鎮(zhèn)痛作用

2.4.1 熱板法測楊桃水提物鎮(zhèn)痛作用

選用雌性小鼠，熱板(55±0.5)℃，觀察小鼠出現(xiàn)舔足的潛伏期，作為痛閾指標(Pain threshold, PT)，選擇痛閾在5～20 s的小鼠30只，采用完全隨機設計分組法分為3組。給藥組灌胃給予楊桃水提取液10.00 g/kg，陽性藥組灌胃給予阿司匹林0.20 g/kg，空白對照組灌胃20 mL/kg蒸餾水。每組給藥前重復測定痛閾值，取2次痛閾平均值作為正常痛閾值，連續(xù)給藥7 d，每天1次，第7天給藥后，在第0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0小時測量小鼠的痛閾值，記錄結(jié)果，計算各組痛閾提高百分率[11](The rate of pain threshold rise, ROPTR)。

痛閾提高百分率=(給藥后痛閾值-給藥

前痛閾值)/給藥前痛閾值×100%

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 楊桃水提物對蛋清致小鼠足跖腫脹作用的影響

結(jié)果見表1，蛋清致小鼠足跖腫脹模型比較成功，空白組腫脹度均值達38.54±15.59 mg，同時楊桃水提物組與空白對照組比較，足跖腫脹度均值下降明顯，腫脹抑制率達36.9%，且差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，表明楊桃水提物減輕蛋清致小鼠足跖炎性腫脹作用明顯。而與阿司匹林組比較，阿司匹林組足跖腫脹度均值較楊桃水提物組更低，腫脹腫脹抑制率更高，達56.9%，表明該試驗劑量下，楊桃水提物減輕蛋清致小鼠足跖炎性腫脹作用不如阿司匹林。

組別Group劑量d(g/kg)足跖質(zhì)量(mg)The weight of hind paws左足Theleft paw右足Theright pawWOPS(mg)ROSI(%)BCG-136.34±7.73176.56±17.0938.54±15.59—AWEG10.00142.28±15.56156.20±15.52?24.30±6.66?36.9AG0.20133.63±11.91154.49±14.20?16.61±8.46??56.9

注：*：p<0.05， **：p<0.01，與BCG對比；

Note: *：p<0.05，**：p<0.01，compare with BCG

3.2 楊桃水提物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹作用的影響

從表2看出，二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型比較成功，空白組小鼠左右耳片差異明顯，同時楊桃水提物組與空白對照組比較，耳廓腫脹度均值下降明顯，腫脹抑制率達39.4%，且差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，表明楊桃水提物減輕蛋清致小鼠足跖炎性腫脹作用明顯。而與阿司匹林組比較，兩組耳廓腫脹度均值相近腫脹抑制率變化不大，表明該試驗劑量下，楊桃水提物減輕蛋清致小鼠耳廓炎性腫脹作用與阿司匹林相當。

3.3 楊桃水提物對熱板所致小鼠疼痛反應的影響

結(jié)果如表3所示，楊桃水提物組、阿司匹林組小鼠給藥后各時段痛閾值的均值較給藥前增加明顯，且差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，表明給藥后楊桃水提物、阿司匹林兩組小鼠對熱刺激的疼痛反應潛伏期痛閾值確實較給藥前提高。而與空白對照組比較，楊桃水提物、阿司匹林兩組痛閾值均值都較空白組提高，且差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05，p<0.01)，證明楊桃水提物與阿司匹林均能明顯延長小鼠對熱刺激的疼痛反應潛伏期痛閾值，提高痛閾值。從給藥后痛閾提高百分率看，在該試驗劑量下，楊桃水提物與阿司匹林延長小鼠對熱刺激的疼痛反應潛伏期痛閾值，提高痛閾值的效果相當。

組別Group劑量d(g/kg)耳片質(zhì)量The weight ofauricle piece(mg)左足Theleft paw右足Theright pawWOPS(mg)ROSI(%)BCG-8.90±0.6019.31±1.269.93±1.73—AWEG10.007.98±0.5613.52±2.77?6.02±3.29#39.4AG0.208.66±0.6515.11±1.51?6.34±1.60?36.2

注：*：p<0.05， **：p<0.01，與BCG對比；

Note: *：p<0.05，**：p<0.01，compare with BCG

4 討論

本試驗中證明了楊桃確實具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛效果，為進一步研究楊桃抗炎鎮(zhèn)痛機制提供了良好的科研基礎。

炎癥是人類疾病中最常見的病理過程，可以發(fā)生于機體任何器官，人類的大多數(shù)疾病都與炎癥有關(guān)。紅、腫、熱、痛及功能改變?yōu)檠装Y臨床上的五大基本表現(xiàn)。而本試驗中小鼠實驗模型其實就是通過免疫反應、物理性致炎因子、化學性致炎因子等的致炎作用，從而達到致痛致腫而建立的，用來驗證楊桃的抗炎鎮(zhèn)痛作用。

蛋清致小鼠足跖腫脹與二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗相似，都是在致炎因子的作用下分別致使小鼠的足跖、耳廓產(chǎn)生炎性腫脹，然后通過控制是否給楊桃水提物，使之與空白組和陽性組對比看其用藥后炎性腫脹度的變化情況，從而驗證楊桃水提物是否具有抗炎作用。而從本試驗中所得數(shù)據(jù)顯示楊桃水提物對蛋清所致小鼠足跖炎性腫脹和二甲苯所致小鼠耳廓炎性腫脹均具有明顯的抑制作用，表明了楊桃具有良好的抗炎作用。

注:a：p<0.05,b：p<0.01，與BCG組對比，“下劃線”：p<0.01，與給藥前對比

Note:a：p<0.05,b：p<0.01，compare with BCG, “ungerline”:p<0.01，compare with The PT before given AWE

高熱是物理性致炎因子，但是本試驗中的熱板法所致疼痛卻主要是神經(jīng)性疼痛，是熱刺激小鼠的足部疼痛感覺神經(jīng)末梢所致的，類似于急性銳痛。而此次我們控制給藥這一變量后，采用的是觀測給藥前后小鼠對熱刺激的疼痛反應潛伏期痛閾值的改變情況，與空白組、陽性組對比后評價楊桃水提物的鎮(zhèn)痛作用。從本試驗數(shù)據(jù)看，楊桃水提物能明顯延長小鼠對熱刺激的疼痛反應潛伏期痛閾值，表明楊桃具有良好的鎮(zhèn)痛作用。特別值得注意的是空白對照組小鼠的給藥后痛閾值的均值、給藥后痛閾提高百分率會隨著熱板觀測的次數(shù)增加而提高。分析其原因：其一，本次觀測的指標是通過觀察小鼠被從放入熱板儀后，到小鼠發(fā)生舔后足行為截止的時間長短來反映小鼠對熱刺激的疼痛反應潛伏期痛閾值，但是小鼠舔后足是一種動物行為，因此會受到動物情緒影響，觀測次數(shù)越多，情緒越激動，舔后足行為發(fā)生越遲，導致測得痛閾提高；其二，生物對環(huán)境都具有適應性，小鼠機體對熱刺激的敏感性隨著觀測次數(shù)的增多而下降，小鼠的足部疼痛感覺神經(jīng)末梢逐漸耐受熱板儀相同溫度的刺激，導致舔后足行為發(fā)生延遲，痛閾提高。

綜上所述，本試驗只是初步證明了楊桃水提物具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，但是該藥有效成分是什么尚不明朗，需要進一步研究。綜合楊桃水提物在蛋清致小鼠足跖腫脹與二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗中的抗炎作用效果，可能與其改善局部血液循環(huán)，減少滲出，加速吸收有關(guān)。將來可以通過檢測炎癥局部的花生四烯酸、前列腺素、緩激肽等[12]的含量分析其抗炎作用機制；通過進行β-內(nèi)啡肽、腦啡肽及強啡肽等[13]的含量分析，探尋其鎮(zhèn)痛機制。