孫 宏，張 恒,2，吳逸飛，沈 琦，李園成，湯江武*，葛向陽

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室，湖北武漢 430030）

畜禽規(guī)模化養(yǎng)殖每年產(chǎn)生大量的養(yǎng)殖污水，特別是經(jīng)厭氧處理后的沼液仍含有高濃度的氮磷、有機物和重金屬等污染物，成為造成水體富營養(yǎng)化的主要因素之一，對自然環(huán)境和人類健康造成嚴重威脅。傳統(tǒng)以活性污泥法為基礎(chǔ)的生化污水處理工藝雖在沼液處理中發(fā)揮了重要作用，但由于沼液碳氮比失衡，仍存在運行不穩(wěn)定、脫氮除磷效果差等諸多弊端，難以實現(xiàn)污水的資源化利用[1]。

微藻是一類在自然界廣泛分布的單細胞生物，能夠在光合作用下利用氮磷等營養(yǎng)鹽進行同化吸收，實現(xiàn)高效的脫氮除磷作用[2]。同時，微藻細胞內(nèi)含有油脂、氨基酸、維生素及多種生物活性物質(zhì)，可用于生產(chǎn)微藻柴油等高附加值產(chǎn)品，從而實現(xiàn)污染物處理和資源化利用相耦合[3-4]。國內(nèi)外研究表明，利用微藻處理污水的關(guān)鍵是篩選能快速適應(yīng)特定環(huán)境并積累生物量的微藻藻株[5]。目前國內(nèi)外在應(yīng)用微藻處理城市生活污水方面已開展了廣泛的研究[6-7]，大大降低了微藻培養(yǎng)的成本。但對篩選適宜于畜禽養(yǎng)殖污水，特別是沼液培養(yǎng)和高效生長的微藻研究仍較少[8-9]，并對如何利用微藻改善沼液水質(zhì)及尋找微藻合適作用條件等方面缺乏系統(tǒng)研究。

本研究通過對豬場沼液中優(yōu)勢微藻的原位篩選分離，生物量、油脂和粗蛋白產(chǎn)率等特征的評價，優(yōu)選獲得適用于沼液處理并具有高生物資源生產(chǎn)潛力的微藻藻株，并探討不同稀釋濃度沼液對該藻株處理效果的影響，以期初步明確合適的作用條件，為其規(guī)模化處理工藝的建立提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 微藻的篩選

1.1.1 沼液水質(zhì)和微藻培養(yǎng)裝置 試驗所用沼液取自浙江安吉吉成牧業(yè)有限公司養(yǎng)殖場厭氧發(fā)酵塔尾端，化學(xué)需氧量（COD）、氨氮、硝酸鹽氮、總氮（TN）、總磷（TP）和pH等水質(zhì)指標見表1。微藻培養(yǎng)裝置包括恒溫光照培養(yǎng)箱和無菌曝氣裝置，主要按照試驗要求調(diào)節(jié)溫度、光照、曝氣量等參數(shù)，裝置示意圖見圖1。

表1 豬場沼液的水質(zhì)指標

圖1 微藻恒溫光照曝氣裝置

1.1.2 微藻的富集篩選和純化 對采集的沼液用8層紗布過濾以去除大顆粒物，滅菌后調(diào)節(jié)pH至7.5，并用無菌水稀釋5倍后取200 mL裝入500 mL錐形瓶，放置于光照培養(yǎng)箱中無菌曝氣培養(yǎng)，光照強度為3 000 lux，溫度25℃，曝氣強度2.0 L/min。待沼液明顯變綠后，在BG-11固體培養(yǎng)基[10]中反復(fù)劃線分離，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，隨后挑取單藻落繼續(xù)接入BG-11液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，并再次劃線分離得到純種微藻，同時采用鏡檢和LB培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定是否存在雜菌污染。

1.1.3 微藻生物量積累及油脂、蛋白質(zhì)產(chǎn)率評價 在微藻培養(yǎng)裝置中，初始微藻接種OD680為0.1，每種微藻各3個培養(yǎng)重復(fù)，光照強度3 000 lux，溫度25℃，曝氣強度2.0 L/min培養(yǎng)15 d，期間每隔3 d檢測微藻生物量的積累，15 d后8 000 r/min離心收集藻液，真空冷凍干燥后，檢測微藻中蛋白和油脂含量并計算產(chǎn)率。

微藻生物量測定采用OD680生物量標準曲線法[7]：通過將純藻液稀釋至OD680為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9，各取200 mL并用0.22 μm濾膜收集，100℃烘至絕干后稱重，得到OD680和相對應(yīng)微藻生物量的標準曲線，通過曲線可計算微藻生物量，生物量產(chǎn)率=培養(yǎng)后微藻生物量（g/L）/培養(yǎng)天數(shù)（d）。

蛋白含量檢測采用凱氏定氮法，油脂含量檢測參照Aravantinou等[11]方法通過索氏提取器用石油醚進行萃取后檢測。

1.1.4 微藻形態(tài)觀察及分子鑒定 對微藻采用臨時制片，對其細胞形態(tài)和大小進行初步判斷。隨后，藻液經(jīng)8 000 r/min離心收集后，用液氮研磨破壁，然后按照植物基因組抽提試劑盒（DP305，Tiangen）步驟提取總DNA。PCR體系所用引物為EukA（5'-AACCTGGTTG ATCCTGCCAGT-3'）、EukB（5'-TGATCCTTCTGCAG GTTCACCTA-3'）。PCR 體系為 10×transtaq Buffer 5 μL（含有15 mmoL/L的Mg2+），dNTP（2.5 mmoL/L）4 μL，上、下游引物（10 μmoL/L）各0.8 μL，DNA模板2 μL（約30 ng），然后用ddH2O補至50 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性 4 min；94℃ 變性 45 s，55℃ 退火 45 min，72℃延伸1 min，共31個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交生工生物工程（上海）有限責(zé)任公司測序。測序得到的18S rDNA序列使用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST程序進行同源性比較分析，應(yīng)用Clustal X 1.82軟件進行序列比對后，通過MEGA 5軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 微藻對沼液處理評價

1.2.1 不同微藻對沼液處理能力的比較 以滅菌稀釋畜禽沼液為培養(yǎng)基，初始微藻接種OD680為0.2，每個試驗組設(shè)3個平行，其余培養(yǎng)條件同1.1.2，每天取樣10 mL微藻培養(yǎng)液于8 000 r/min下離心10 min后收集上清，檢測水質(zhì)指標變化情況。每次取樣前補加滅菌去離子水至原刻度線，調(diào)節(jié)pH至原值。

水質(zhì)指標檢測：COD含量采用《水質(zhì)化學(xué)需氧量的測定-重鉻酸鹽法》（GB 11914-89），氨氮檢測采用《水質(zhì)氨氮的測定-水楊酸分光光度法》（GB 7481-87），硝酸鹽氮含量檢測采用《水質(zhì)硝酸鹽氮的測定-紫外分光光度法》（HZ-HJ-SZ-0138），TN含量檢測采用《水質(zhì)總氮的測定-堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》（GB-11894-89），TP檢測采用《水質(zhì)總磷的測定-鉬酸銨分光光度法》（GB 11893-89）。

1.2.2 不同稀釋濃度對微藻CS-3降解沼液中污染物的評價 對畜禽沼液采用紗布過濾，高溫滅菌后，用無菌水進行2倍、4倍和6倍稀釋處理，并以不稀釋沼液為對照，每個試驗組設(shè)3個平行，初始微藻接種OD680為0.1，調(diào)節(jié)pH 7.5～8.0，光照強度3 000 lux，溫度25℃，曝氣強度為2.0 L/min下培養(yǎng)10 d，每隔2 d取樣，3 000 r/min離心10 min后收集上清，測定水樣中COD、氨氮、硝酸鹽氮、TN、TP和微藻生物量。

1.3 統(tǒng)計分析 采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標準差表示，并采用SPSS 13.0進行單因子方差分析，多重比較采用Duncan's檢驗，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻的生物量積累及油脂、蛋白質(zhì)產(chǎn)率評價 經(jīng)過多次富集篩選，獲得4株平板形態(tài)差異較大的微藻株，分別命名為CS-1、CS-2、CS-3和CS-4。其在BG-11培養(yǎng)基上的生物量積累曲線（圖2）表明，除藻株CS-4外，其余3株微藻的生物量均隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸積累，在15 d時，CS-1、CS-2和CS-3的生物量分別可達到1.49、1.52、1.91 g/L，以CS-3的生物量最高；而藻株CS-4生物量在6 d時達到最高，為0.76 g/L，后隨著培養(yǎng)時間延長，生物量逐漸降低。

圖2 篩選微藻在BG-11培養(yǎng)基中的生長趨勢

篩選微藻在BG-11培養(yǎng)基中生物量、油脂和蛋白質(zhì)積累情況如表2所示，藻株 CS-3的生物量產(chǎn)率、蛋白產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率和細胞內(nèi)油脂含量均顯著高于其余藻株（P＜0.05）；藻株CS-3和CS-4的細胞內(nèi)蛋白含量顯著高于CS-1和CS-2（P＜0.05）。

2.2 目標微藻的生物學(xué)鑒定 綜合微藻在BG-11培養(yǎng)基上的生物量積累及油脂、蛋白質(zhì)產(chǎn)率情況，篩選出微藻CS-3為最佳藻株。該藻株在BG-11平板上呈深綠色圓形藻落，顯微鏡下觀察直徑為4～6 μm，呈球形（圖3-A），體積較大。18S rDNA測序結(jié)果顯示，該株微藻與普通小球藻（Chlorella sorokiniana）相似度最高，達到99%（圖3-B）。

圖3 小球藻CS-3在顯微鏡下的單藻形態(tài)（A）和基于18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（B）

2.3 不同微藻對沼液處理能力的比較 與對照組相比，添加4株微藻均對稀釋沼液中的氮磷及COD有較好的去除效果。氨氮方面（圖4-A），與對照相比，4株微藻均可在4 d內(nèi)實現(xiàn)氨氮的完全降解；其中藻株CS-3對硝酸鹽氮、TN、TP和COD去除效果最好（圖4-B～E），8 d后去除率分別達到94.5%、90.0%、94.8%和46.1%。同時，4株微藻均可在稀釋藻液中實現(xiàn)生物量積累（圖4-F），在8 d時，微藻CS-3的生物量積累最高，達到1.66 g/L。

2.4 微藻CS-3對不同稀釋濃度沼液中污染物降解能力的評價 由圖5可知，隨著沼液稀釋倍數(shù)的增加，小球藻CS-3的生物量產(chǎn)率明顯增加，在6倍稀釋沼液中經(jīng)過10 d的培養(yǎng)，生物量最高為1.31 g/L（圖5-A）。沼液中TN、氨氮和硝酸鹽氮的去除率隨著稀釋倍數(shù)的增加而增加，在4倍和6倍稀釋條件下，經(jīng)過10 d處理，沼液中氨氮去除率為98.4%和98.2%，TN去除率為96.4%和94.4%；在4倍和6倍稀釋條件下，培養(yǎng)4 d后沼液中硝酸鹽氮基本完全降解；而在不稀釋條件下，硝酸鹽氮降解效果差，10 d后降解率僅為52.2%（圖5-D）。COD降解方面（圖5-E），CS-3對6倍稀釋沼液的降解效果最高為56.6%，而對不稀釋試驗組的COD降解率僅為34.90%。此外，在4倍和6倍稀釋濃度下，微藻CS-3對沼液中TP的降解率分別為100%和96.2%（圖5-F）。

表2 篩選微藻在BG-11培養(yǎng)基中生物量、油脂和蛋白質(zhì)積累情況

圖4 微藻處理畜禽沼液對污染物指標的影響及其生物量積累變化

3 討 論

圖5 小球藻CS-3處理不同稀釋倍數(shù)豬場沼液后生物量積累和各污染物的降解情況

3.1 微藻生物量的積累和蛋白、油脂產(chǎn)率 本研究通過畜禽沼液原位篩選出1株小球藻CS-3，該藻株具有較優(yōu)異的氮磷去除能力及較高的生物量、油脂和蛋白積累能力，為微藻處理畜禽污水同時藕聯(lián)生物質(zhì)資源生產(chǎn)提供了理想藻株。研究表明，自然篩選的微藻在化學(xué)合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)達到穩(wěn)定生長期需要9～12 d[12]，本研究所篩選的微藻符合該生長行為。但本試驗獲得的微藻CS-3的生物量產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率分別為0.124 、0.046 g/（L·d），遠高于 Abdelaziz等[12]報道的湖泊和河流來源的微藻最高生物量產(chǎn)率0.093 g/（L·d）和油脂產(chǎn)率0.029 g/（L·d）。該結(jié)果表明不同來源微藻的生長與油脂積累能力存在差異[13]。本研究中小球藻CS-3的油脂含量與江麗麗等[14]從淡水水體中獲得藻株最高達39.7%的油脂含量一致。微藻油脂含量的積累受到培養(yǎng)基內(nèi)氮素含量的嚴格調(diào)控，當?shù)刳呌诶猛戤厱r，藻類將傾向于更多地積累油脂成分用以抵御營養(yǎng)缺乏和環(huán)境壓力[15]。因而，本研究中CS-3的高油脂含量可能與其生物量快速積累后，氮素供給下降有關(guān)，需要進一步研究。賀國強等[16]從湖泊等自然水域篩選高油脂產(chǎn)率微藻并進行發(fā)酵條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，油脂含量可從優(yōu)化前的20.3%提高到23.2%，油脂產(chǎn)率可從0.324 g/（L·d）提高到 1.233 g/（L·d），表明培養(yǎng)條件優(yōu)化可進一步提升微藻產(chǎn)油脂能力。除高油脂含量外，CS-3較其余藻株還具有最高的蛋白含量積累。Jebali等[5]所篩選的含油微藻的蛋白含量一般在11.1%～19.1%，顯著低于本研究中34.2%的蛋白含量，表明藻株CS-3對污水中的含氮化合物有較強的吸收利用能力，從而進一步提高了其對高含氮污水的凈化效果。

3.2 微藻處理沼液的效果 目前，采用微藻處理沼液的研究仍較少，主要原因是其生長速率遠低于異養(yǎng)微生物，且需要充足的光照和合適的溫度、pH和營養(yǎng)鹽組成等條件[17]。本研究中藻株CS-3處理稀釋沼液較其余藻株具有更優(yōu)的硝酸鹽氮、TN、TP和COD去除效果，去除率分別達到94.5%、90.0%、94.8%和46.1%，且不受沼液中低C/N的限制。該結(jié)果優(yōu)于Wang等[8]采用微藻處理稀釋豬場污水后污水總氮（74.6%）和總磷（77.7%）的去除率；也同樣高于Aravantinou等[11]報道的微藻處理模擬污水后最高53%的總磷降解率。氮磷去除率的差異可能與藻株不同、污水污染物濃度差異和污水的稀釋倍數(shù)不同有關(guān)[13,16,18]。韓松芳等[7]采用蛋白核小球藻處理城市污水后發(fā)現(xiàn)，污水中COD、氨氮、TN、TP的去除率分別可達到81.8%、100%、94.9%和94.2%。值得注意的是，本研究中TN的減少量高于氨氮的去除量，表明微藻利用了除氨氮外的多種氮源進行生長，這與李巖等[19]的報道一致。同時本研究中對照組氨氮含量也有降低，這可能與培養(yǎng)曝氣過程中的氮吹脫效應(yīng)有關(guān)，并進一步造成對照組中TN含量也略有降低[20]。由此可知，本試驗中微藻對TN的降解可包括2方面的作用，即微藻的吸收轉(zhuǎn)化和氨氮自身的吹脫。本研究中藻株CS-3利用沼液培養(yǎng)后，實現(xiàn)了較高的生物量積累，并與常規(guī)培養(yǎng)基BG-11的生物量積累差異不明顯，進一步表明藻株CS-3較適合于沼液的處理。此外，研究表明微藻對氨氮濃度較為敏感，但在氨氮降低時，硝酸鹽氮對微藻的生長基本無抑制作用[21]，因而藻株CS-3較適用于現(xiàn)有生化污泥處理工藝，如缺氧-好氧工藝的末端，處理含高濃度硝酸鹽氮的污水，以實現(xiàn)深度的脫氮和除磷[22]。同時考慮到微藻在生長后期較易沉降，較易實現(xiàn)微藻的回收，進一步降低了微藻后期制備生物柴油的生產(chǎn)成本[23]。

另一方面，氮素是影響微藻生長代謝的重要營養(yǎng)限制因子。本研究中，微藻對氨氮和硝酸鹽氮的去除具有明顯的先后順序，表現(xiàn)為優(yōu)先利用氨氮（氨氮的去除率高），當氨氮在培養(yǎng)4 d利用完后，硝酸鹽氮含量開始顯著降低。王利燕等[18]研究也表明，藻類吸收利用的氮源主要為氨氮和硝酸鹽氮，且以氨氮的利用最為優(yōu)先。本研究中氮源消耗速度最快的CS-3具有最高的生物量積累和油脂產(chǎn)率，提示CS-3同時利用氨氮和硝酸鹽氮進行生長代謝。汪亞俊等[24]研究表明，微藻在氮素降低或受到限制時可短時間內(nèi)進一步促進藻類的生長，同時增加油脂積累。該具體代謝機制與葉綠體在氮素快速消耗時大量降解以提供藻類細胞生長有關(guān)[25]，但仍需進一步研究。

3.3 不同稀釋濃度沼液對CS-3降解污染物能力的影響目前，有關(guān)不同稀釋濃度沼液對微藻培養(yǎng)影響的研究報道較少[18,21]。本研究通過藻株CS-3處理不同稀釋倍數(shù)的沼液后發(fā)現(xiàn)，在稀釋倍數(shù)較高的條件下（4倍和6倍），微藻脫氮除磷效率和生長情況優(yōu)異，氮磷去除率均在90%以上，而低稀釋倍數(shù)的沼液（2倍和不稀釋）對CS-3的生長和降解能力有明顯的抑制作用。研究表明，沼液不利于微藻生長的主要原因可能包括2個方面：一是沼液中氨氮濃度過高會對微藻有明顯的氨抑制和毒害作用，造成微藻老化和同化氮磷能力的減弱進而死亡[26]；二是沼液本身色度過高，不加稀釋使用將直接影響微藻正常的光合作用[27]。因此稀釋沼液是解決上述問題的有效方式。稀釋沼液過程中應(yīng)考慮稀釋對沼液中其他營養(yǎng)元素，如氨基酸、蛋白質(zhì)和生長激素等的稀釋作用，因而需要控制在合適的范圍[21]。王利燕等[18]報道，適合小球藻的合適沼液稀釋倍數(shù)為4倍和8倍。同樣有研究報道合適的沼液培藻濃度應(yīng)至少控制氨氮含量在300 mg/L以下[28]。另一方面，也有研究通過馴化篩選耐高濃度污染物的微藻以提高其處理效率，如Wang等[29]利用紫外線對沼液處理效果較好的2株微藻進行照射并逐步馴化，最終實現(xiàn)了微藻在不稀釋的豬場沼液中良好生長，TN和TP去除率分別達到89.5%和85.3%。因此，本研究中微藻CS-3下一步可嘗試通過高濃度沼液馴化或采取多輪培養(yǎng)等方式，提高其對沼液的去除效果。

4 結(jié) 論

本研究從豬場沼液中富集篩選獲得氮磷去除及生物量、油脂和蛋白積累能力優(yōu)異的凈水微藻株CS-3，經(jīng)鑒定屬于小球藻屬（Chlorella sp.）。微藻CS-3對沼液的處理效果隨其稀釋倍數(shù)差異而不同。在本試驗條件下，較為合適的沼液稀釋倍數(shù)為4倍和6倍。