孫 宏，張 恒,2，吳逸飛，沈 琦，李園成，湯江武*，葛向陽

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430030）

畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖每年產(chǎn)生大量的養(yǎng)殖污水，特別是經(jīng)厭氧處理后的沼液仍含有高濃度的氮磷、有機(jī)物和重金屬等污染物，成為造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要因素之一，對(duì)自然環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重威脅。傳統(tǒng)以活性污泥法為基礎(chǔ)的生化污水處理工藝雖在沼液處理中發(fā)揮了重要作用，但由于沼液碳氮比失衡，仍存在運(yùn)行不穩(wěn)定、脫氮除磷效果差等諸多弊端，難以實(shí)現(xiàn)污水的資源化利用[1]。

微藻是一類在自然界廣泛分布的單細(xì)胞生物，能夠在光合作用下利用氮磷等營(yíng)養(yǎng)鹽進(jìn)行同化吸收，實(shí)現(xiàn)高效的脫氮除磷作用[2]。同時(shí)，微藻細(xì)胞內(nèi)含有油脂、氨基酸、維生素及多種生物活性物質(zhì)，可用于生產(chǎn)微藻柴油等高附加值產(chǎn)品，從而實(shí)現(xiàn)污染物處理和資源化利用相耦合[3-4]。國(guó)內(nèi)外研究表明，利用微藻處理污水的關(guān)鍵是篩選能快速適應(yīng)特定環(huán)境并積累生物量的微藻藻株[5]。目前國(guó)內(nèi)外在應(yīng)用微藻處理城市生活污水方面已開展了廣泛的研究[6-7]，大大降低了微藻培養(yǎng)的成本。但對(duì)篩選適宜于畜禽養(yǎng)殖污水，特別是沼液培養(yǎng)和高效生長(zhǎng)的微藻研究仍較少[8-9]，并對(duì)如何利用微藻改善沼液水質(zhì)及尋找微藻合適作用條件等方面缺乏系統(tǒng)研究。

本研究通過對(duì)豬場(chǎng)沼液中優(yōu)勢(shì)微藻的原位篩選分離，生物量、油脂和粗蛋白產(chǎn)率等特征的評(píng)價(jià)，優(yōu)選獲得適用于沼液處理并具有高生物資源生產(chǎn)潛力的微藻藻株，并探討不同稀釋濃度沼液對(duì)該藻株處理效果的影響，以期初步明確合適的作用條件，為其規(guī)?；幚砉に嚨慕⑻峁?shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 微藻的篩選

1.1.1 沼液水質(zhì)和微藻培養(yǎng)裝置 試驗(yàn)所用沼液取自浙江安吉吉成牧業(yè)有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)厭氧發(fā)酵塔尾端，化學(xué)需氧量（COD）、氨氮、硝酸鹽氮、總氮（TN）、總磷（TP）和pH等水質(zhì)指標(biāo)見表1。微藻培養(yǎng)裝置包括恒溫光照培養(yǎng)箱和無菌曝氣裝置，主要按照試驗(yàn)要求調(diào)節(jié)溫度、光照、曝氣量等參數(shù)，裝置示意圖見圖1。

表1 豬場(chǎng)沼液的水質(zhì)指標(biāo)

圖1 微藻恒溫光照曝氣裝置

1.1.2 微藻的富集篩選和純化 對(duì)采集的沼液用8層紗布過濾以去除大顆粒物，滅菌后調(diào)節(jié)pH至7.5，并用無菌水稀釋5倍后取200 mL裝入500 mL錐形瓶，放置于光照培養(yǎng)箱中無菌曝氣培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3 000 lux，溫度25℃，曝氣強(qiáng)度2.0 L/min。待沼液明顯變綠后，在BG-11固體培養(yǎng)基[10]中反復(fù)劃線分離，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，隨后挑取單藻落繼續(xù)接入BG-11液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，并再次劃線分離得到純種微藻，同時(shí)采用鏡檢和LB培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定是否存在雜菌污染。

1.1.3 微藻生物量積累及油脂、蛋白質(zhì)產(chǎn)率評(píng)價(jià) 在微藻培養(yǎng)裝置中，初始微藻接種OD680為0.1，每種微藻各3個(gè)培養(yǎng)重復(fù)，光照強(qiáng)度3 000 lux，溫度25℃，曝氣強(qiáng)度2.0 L/min培養(yǎng)15 d，期間每隔3 d檢測(cè)微藻生物量的積累，15 d后8 000 r/min離心收集藻液，真空冷凍干燥后，檢測(cè)微藻中蛋白和油脂含量并計(jì)算產(chǎn)率。

微藻生物量測(cè)定采用OD680生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線法[7]：通過將純?cè)逡合♂屩罯D680為0.1、0.3、0.5、0.7和0.9，各取200 mL并用0.22 μm濾膜收集，100℃烘至絕干后稱重，得到OD680和相對(duì)應(yīng)微藻生物量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過曲線可計(jì)算微藻生物量，生物量產(chǎn)率=培養(yǎng)后微藻生物量（g/L）/培養(yǎng)天數(shù)（d）。

蛋白含量檢測(cè)采用凱氏定氮法，油脂含量檢測(cè)參照Aravantinou等[11]方法通過索氏提取器用石油醚進(jìn)行萃取后檢測(cè)。

1.1.4 微藻形態(tài)觀察及分子鑒定 對(duì)微藻采用臨時(shí)制片，對(duì)其細(xì)胞形態(tài)和大小進(jìn)行初步判斷。隨后，藻液經(jīng)8 000 r/min離心收集后，用液氮研磨破壁，然后按照植物基因組抽提試劑盒（DP305，Tiangen）步驟提取總DNA。PCR體系所用引物為EukA（5'-AACCTGGTTG ATCCTGCCAGT-3'）、EukB（5'-TGATCCTTCTGCAG GTTCACCTA-3'）。PCR 體系為 10×transtaq Buffer 5 μL（含有15 mmoL/L的Mg2+），dNTP（2.5 mmoL/L）4 μL，上、下游引物（10 μmoL/L）各0.8 μL，DNA模板2 μL（約30 ng），然后用ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性 4 min；94℃ 變性 45 s，55℃ 退火 45 min，72℃延伸1 min，共31個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送交生工生物工程（上海）有限責(zé)任公司測(cè)序。測(cè)序得到的18S rDNA序列使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST程序進(jìn)行同源性比較分析，應(yīng)用Clustal X 1.82軟件進(jìn)行序列比對(duì)后，通過MEGA 5軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 微藻對(duì)沼液處理評(píng)價(jià)

1.2.1 不同微藻對(duì)沼液處理能力的比較 以滅菌稀釋畜禽沼液為培養(yǎng)基，初始微藻接種OD680為0.2，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行，其余培養(yǎng)條件同1.1.2，每天取樣10 mL微藻培養(yǎng)液于8 000 r/min下離心10 min后收集上清，檢測(cè)水質(zhì)指標(biāo)變化情況。每次取樣前補(bǔ)加滅菌去離子水至原刻度線，調(diào)節(jié)pH至原值。

水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)：COD含量采用《水質(zhì)化學(xué)需氧量的測(cè)定-重鉻酸鹽法》（GB 11914-89），氨氮檢測(cè)采用《水質(zhì)氨氮的測(cè)定-水楊酸分光光度法》（GB 7481-87），硝酸鹽氮含量檢測(cè)采用《水質(zhì)硝酸鹽氮的測(cè)定-紫外分光光度法》（HZ-HJ-SZ-0138），TN含量檢測(cè)采用《水質(zhì)總氮的測(cè)定-堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》（GB-11894-89），TP檢測(cè)采用《水質(zhì)總磷的測(cè)定-鉬酸銨分光光度法》（GB 11893-89）。

1.2.2 不同稀釋濃度對(duì)微藻CS-3降解沼液中污染物的評(píng)價(jià) 對(duì)畜禽沼液采用紗布過濾，高溫滅菌后，用無菌水進(jìn)行2倍、4倍和6倍稀釋處理，并以不稀釋沼液為對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行，初始微藻接種OD680為0.1，調(diào)節(jié)pH 7.5～8.0，光照強(qiáng)度3 000 lux，溫度25℃，曝氣強(qiáng)度為2.0 L/min下培養(yǎng)10 d，每隔2 d取樣，3 000 r/min離心10 min后收集上清，測(cè)定水樣中COD、氨氮、硝酸鹽氮、TN、TP和微藻生物量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 13.0進(jìn)行單因子方差分析，多重比較采用Duncan's檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻的生物量積累及油脂、蛋白質(zhì)產(chǎn)率評(píng)價(jià) 經(jīng)過多次富集篩選，獲得4株平板形態(tài)差異較大的微藻株，分別命名為CS-1、CS-2、CS-3和CS-4。其在BG-11培養(yǎng)基上的生物量積累曲線（圖2）表明，除藻株CS-4外，其余3株微藻的生物量均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸積累，在15 d時(shí)，CS-1、CS-2和CS-3的生物量分別可達(dá)到1.49、1.52、1.91 g/L，以CS-3的生物量最高；而藻株CS-4生物量在6 d時(shí)達(dá)到最高，為0.76 g/L，后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，生物量逐漸降低。

圖2 篩選微藻在BG-11培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)

篩選微藻在BG-11培養(yǎng)基中生物量、油脂和蛋白質(zhì)積累情況如表2所示，藻株 CS-3的生物量產(chǎn)率、蛋白產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率和細(xì)胞內(nèi)油脂含量均顯著高于其余藻株（P＜0.05）；藻株CS-3和CS-4的細(xì)胞內(nèi)蛋白含量顯著高于CS-1和CS-2（P＜0.05）。

2.2 目標(biāo)微藻的生物學(xué)鑒定 綜合微藻在BG-11培養(yǎng)基上的生物量積累及油脂、蛋白質(zhì)產(chǎn)率情況，篩選出微藻CS-3為最佳藻株。該藻株在BG-11平板上呈深綠色圓形藻落，顯微鏡下觀察直徑為4～6 μm，呈球形（圖3-A），體積較大。18S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，該株微藻與普通小球藻（Chlorella sorokiniana）相似度最高，達(dá)到99%（圖3-B）。

圖3 小球藻CS-3在顯微鏡下的單藻形態(tài)（A）和基于18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（B）

2.3 不同微藻對(duì)沼液處理能力的比較 與對(duì)照組相比，添加4株微藻均對(duì)稀釋沼液中的氮磷及COD有較好的去除效果。氨氮方面（圖4-A），與對(duì)照相比，4株微藻均可在4 d內(nèi)實(shí)現(xiàn)氨氮的完全降解；其中藻株CS-3對(duì)硝酸鹽氮、TN、TP和COD去除效果最好（圖4-B～E），8 d后去除率分別達(dá)到94.5%、90.0%、94.8%和46.1%。同時(shí)，4株微藻均可在稀釋藻液中實(shí)現(xiàn)生物量積累（圖4-F），在8 d時(shí)，微藻CS-3的生物量積累最高，達(dá)到1.66 g/L。

2.4 微藻CS-3對(duì)不同稀釋濃度沼液中污染物降解能力的評(píng)價(jià) 由圖5可知，隨著沼液稀釋倍數(shù)的增加，小球藻CS-3的生物量產(chǎn)率明顯增加，在6倍稀釋沼液中經(jīng)過10 d的培養(yǎng)，生物量最高為1.31 g/L（圖5-A）。沼液中TN、氨氮和硝酸鹽氮的去除率隨著稀釋倍數(shù)的增加而增加，在4倍和6倍稀釋條件下，經(jīng)過10 d處理，沼液中氨氮去除率為98.4%和98.2%，TN去除率為96.4%和94.4%；在4倍和6倍稀釋條件下，培養(yǎng)4 d后沼液中硝酸鹽氮基本完全降解；而在不稀釋條件下，硝酸鹽氮降解效果差，10 d后降解率僅為52.2%（圖5-D）。COD降解方面（圖5-E），CS-3對(duì)6倍稀釋沼液的降解效果最高為56.6%，而對(duì)不稀釋試驗(yàn)組的COD降解率僅為34.90%。此外，在4倍和6倍稀釋濃度下，微藻CS-3對(duì)沼液中TP的降解率分別為100%和96.2%（圖5-F）。

表2 篩選微藻在BG-11培養(yǎng)基中生物量、油脂和蛋白質(zhì)積累情況

圖4 微藻處理畜禽沼液對(duì)污染物指標(biāo)的影響及其生物量積累變化

3 討 論

圖5 小球藻CS-3處理不同稀釋倍數(shù)豬場(chǎng)沼液后生物量積累和各污染物的降解情況

3.1 微藻生物量的積累和蛋白、油脂產(chǎn)率 本研究通過畜禽沼液原位篩選出1株小球藻CS-3，該藻株具有較優(yōu)異的氮磷去除能力及較高的生物量、油脂和蛋白積累能力，為微藻處理畜禽污水同時(shí)藕聯(lián)生物質(zhì)資源生產(chǎn)提供了理想藻株。研究表明，自然篩選的微藻在化學(xué)合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期需要9～12 d[12]，本研究所篩選的微藻符合該生長(zhǎng)行為。但本試驗(yàn)獲得的微藻CS-3的生物量產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率分別為0.124 、0.046 g/（L·d），遠(yuǎn)高于 Abdelaziz等[12]報(bào)道的湖泊和河流來源的微藻最高生物量產(chǎn)率0.093 g/（L·d）和油脂產(chǎn)率0.029 g/（L·d）。該結(jié)果表明不同來源微藻的生長(zhǎng)與油脂積累能力存在差異[13]。本研究中小球藻CS-3的油脂含量與江麗麗等[14]從淡水水體中獲得藻株最高達(dá)39.7%的油脂含量一致。微藻油脂含量的積累受到培養(yǎng)基內(nèi)氮素含量的嚴(yán)格調(diào)控，當(dāng)?shù)刳呌诶猛戤厱r(shí)，藻類將傾向于更多地積累油脂成分用以抵御營(yíng)養(yǎng)缺乏和環(huán)境壓力[15]。因而，本研究中CS-3的高油脂含量可能與其生物量快速積累后，氮素供給下降有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。賀國(guó)強(qiáng)等[16]從湖泊等自然水域篩選高油脂產(chǎn)率微藻并進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，油脂含量可從優(yōu)化前的20.3%提高到23.2%，油脂產(chǎn)率可從0.324 g/（L·d）提高到 1.233 g/（L·d），表明培養(yǎng)條件優(yōu)化可進(jìn)一步提升微藻產(chǎn)油脂能力。除高油脂含量外，CS-3較其余藻株還具有最高的蛋白含量積累。Jebali等[5]所篩選的含油微藻的蛋白含量一般在11.1%～19.1%，顯著低于本研究中34.2%的蛋白含量，表明藻株CS-3對(duì)污水中的含氮化合物有較強(qiáng)的吸收利用能力，從而進(jìn)一步提高了其對(duì)高含氮污水的凈化效果。

3.2 微藻處理沼液的效果 目前，采用微藻處理沼液的研究仍較少，主要原因是其生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)低于異養(yǎng)微生物，且需要充足的光照和合適的溫度、pH和營(yíng)養(yǎng)鹽組成等條件[17]。本研究中藻株CS-3處理稀釋沼液較其余藻株具有更優(yōu)的硝酸鹽氮、TN、TP和COD去除效果，去除率分別達(dá)到94.5%、90.0%、94.8%和46.1%，且不受沼液中低C/N的限制。該結(jié)果優(yōu)于Wang等[8]采用微藻處理稀釋豬場(chǎng)污水后污水總氮（74.6%）和總磷（77.7%）的去除率；也同樣高于Aravantinou等[11]報(bào)道的微藻處理模擬污水后最高53%的總磷降解率。氮磷去除率的差異可能與藻株不同、污水污染物濃度差異和污水的稀釋倍數(shù)不同有關(guān)[13,16,18]。韓松芳等[7]采用蛋白核小球藻處理城市污水后發(fā)現(xiàn)，污水中COD、氨氮、TN、TP的去除率分別可達(dá)到81.8%、100%、94.9%和94.2%。值得注意的是，本研究中TN的減少量高于氨氮的去除量，表明微藻利用了除氨氮外的多種氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，這與李巖等[19]的報(bào)道一致。同時(shí)本研究中對(duì)照組氨氮含量也有降低，這可能與培養(yǎng)曝氣過程中的氮吹脫效應(yīng)有關(guān)，并進(jìn)一步造成對(duì)照組中TN含量也略有降低[20]。由此可知，本試驗(yàn)中微藻對(duì)TN的降解可包括2方面的作用，即微藻的吸收轉(zhuǎn)化和氨氮自身的吹脫。本研究中藻株CS-3利用沼液培養(yǎng)后，實(shí)現(xiàn)了較高的生物量積累，并與常規(guī)培養(yǎng)基BG-11的生物量積累差異不明顯，進(jìn)一步表明藻株CS-3較適合于沼液的處理。此外，研究表明微藻對(duì)氨氮濃度較為敏感，但在氨氮降低時(shí)，硝酸鹽氮對(duì)微藻的生長(zhǎng)基本無抑制作用[21]，因而藻株CS-3較適用于現(xiàn)有生化污泥處理工藝，如缺氧-好氧工藝的末端，處理含高濃度硝酸鹽氮的污水，以實(shí)現(xiàn)深度的脫氮和除磷[22]。同時(shí)考慮到微藻在生長(zhǎng)后期較易沉降，較易實(shí)現(xiàn)微藻的回收，進(jìn)一步降低了微藻后期制備生物柴油的生產(chǎn)成本[23]。

另一方面，氮素是影響微藻生長(zhǎng)代謝的重要營(yíng)養(yǎng)限制因子。本研究中，微藻對(duì)氨氮和硝酸鹽氮的去除具有明顯的先后順序，表現(xiàn)為優(yōu)先利用氨氮（氨氮的去除率高），當(dāng)氨氮在培養(yǎng)4 d利用完后，硝酸鹽氮含量開始顯著降低。王利燕等[18]研究也表明，藻類吸收利用的氮源主要為氨氮和硝酸鹽氮，且以氨氮的利用最為優(yōu)先。本研究中氮源消耗速度最快的CS-3具有最高的生物量積累和油脂產(chǎn)率，提示CS-3同時(shí)利用氨氮和硝酸鹽氮進(jìn)行生長(zhǎng)代謝。汪亞俊等[24]研究表明，微藻在氮素降低或受到限制時(shí)可短時(shí)間內(nèi)進(jìn)一步促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)，同時(shí)增加油脂積累。該具體代謝機(jī)制與葉綠體在氮素快速消耗時(shí)大量降解以提供藻類細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)[25]，但仍需進(jìn)一步研究。

3.3 不同稀釋濃度沼液對(duì)CS-3降解污染物能力的影響目前，有關(guān)不同稀釋濃度沼液對(duì)微藻培養(yǎng)影響的研究報(bào)道較少[18,21]。本研究通過藻株CS-3處理不同稀釋倍數(shù)的沼液后發(fā)現(xiàn)，在稀釋倍數(shù)較高的條件下（4倍和6倍），微藻脫氮除磷效率和生長(zhǎng)情況優(yōu)異，氮磷去除率均在90%以上，而低稀釋倍數(shù)的沼液（2倍和不稀釋）對(duì)CS-3的生長(zhǎng)和降解能力有明顯的抑制作用。研究表明，沼液不利于微藻生長(zhǎng)的主要原因可能包括2個(gè)方面：一是沼液中氨氮濃度過高會(huì)對(duì)微藻有明顯的氨抑制和毒害作用，造成微藻老化和同化氮磷能力的減弱進(jìn)而死亡[26]；二是沼液本身色度過高，不加稀釋使用將直接影響微藻正常的光合作用[27]。因此稀釋沼液是解決上述問題的有效方式。稀釋沼液過程中應(yīng)考慮稀釋對(duì)沼液中其他營(yíng)養(yǎng)元素，如氨基酸、蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)激素等的稀釋作用，因而需要控制在合適的范圍[21]。王利燕等[18]報(bào)道，適合小球藻的合適沼液稀釋倍數(shù)為4倍和8倍。同樣有研究報(bào)道合適的沼液培藻濃度應(yīng)至少控制氨氮含量在300 mg/L以下[28]。另一方面，也有研究通過馴化篩選耐高濃度污染物的微藻以提高其處理效率，如Wang等[29]利用紫外線對(duì)沼液處理效果較好的2株微藻進(jìn)行照射并逐步馴化，最終實(shí)現(xiàn)了微藻在不稀釋的豬場(chǎng)沼液中良好生長(zhǎng)，TN和TP去除率分別達(dá)到89.5%和85.3%。因此，本研究中微藻CS-3下一步可嘗試通過高濃度沼液馴化或采取多輪培養(yǎng)等方式，提高其對(duì)沼液的去除效果。

4 結(jié) 論

本研究從豬場(chǎng)沼液中富集篩選獲得氮磷去除及生物量、油脂和蛋白積累能力優(yōu)異的凈水微藻株CS-3，經(jīng)鑒定屬于小球藻屬（Chlorella sp.）。微藻CS-3對(duì)沼液的處理效果隨其稀釋倍數(shù)差異而不同。在本試驗(yàn)條件下，較為合適的沼液稀釋倍數(shù)為4倍和6倍。