郝 軍，王吉坤，柴志欣，王 會，信金偉，鐘金城*

（1.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，四川省重點實驗室，西南民族大學(xué)，四川成都 610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩 850009）

牦牛（Bos grunniens）是一種主要分布在以青藏高原為中心及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的特有畜種[1]，是唯一能適應(yīng)青藏高原高寒牧區(qū)惡劣生態(tài)環(huán)境而生存至今的家養(yǎng)牛種，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民提供肉、乳、毛、皮等重要生產(chǎn)生活資料，被譽為“高原之舟”[2]。

孤兒型G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-Coupled Receptor41，GPR41）是短鏈脂肪酸的受體之一[3-4]。短鏈脂肪酸能夠為反芻動物提供75%的能量[5]，可激活GPR41調(diào)節(jié)脂肪代謝[6]。牛GPR41基因主要包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，定位于牛18號染色體，該受體在人、鼠、牛、羊等物種間高度保守[7]。近年來，相關(guān)研究表明GPR41基因?qū)C(jī)體內(nèi)脂肪形成和腸道營養(yǎng)吸收具有重要的調(diào)節(jié)作用。Zaibi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，GPR41基因在小鼠脂肪組織中表達(dá)并通過Gai介導(dǎo)短鏈脂肪酸刺激瘦素分泌，促使脂肪和能量代謝。Meza-Cuenca等[9]肥胖大鼠腹部脂肪細(xì)胞中GPR41 mRNA的表達(dá)較對照組顯著增加，說明GPR41在脂肪形成過程中發(fā)揮重要作用。馬娜娜等[10]用高精料日糧飼喂奶牛，發(fā)現(xiàn)瘤胃和盲腸組織中GPR41表達(dá)量顯著提高。以上研究均揭示了GPR41可能對家畜肉品質(zhì)或能量代謝起關(guān)鍵作用，而肉品質(zhì)性狀和能量代謝也是家畜生長性狀的變相體現(xiàn)，篩選對牦牛生長發(fā)育有利的候選基因，對促進(jìn)當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要社會價值。

截止目前，關(guān)于牦牛GPR41基因的研究尚未見報道。本研究利用PCR- RFLP分子遺傳標(biāo)記檢測GPR41基因多態(tài)位點，分析其SNPs不同基因型對牦牛生長性狀的影響，為牦牛品種改良和選育工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康的麥洼牦牛（50頭）、申扎牦牛（47頭）和類烏齊牦牛（28頭），采集耳組織，75%乙醇保存，帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆?。在采集樣品時，對牦牛的體重、體高、體斜長、胸圍、管圍等生長指標(biāo)進(jìn)行測量記錄。

1.2 基因組DNA提取 用動物組織DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增 參考GenBank中牛GPR41基因序列（NW_003104465.1）的外顯子區(qū)域，利用Primer 5.0軟件設(shè)計2對特異性引物（表1），對外顯子1和2區(qū)域分別進(jìn)行擴(kuò)增，引物送英濰捷基（上海）生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：上、游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA模板1.0 μL，Taq mix（2×）聚合酶12.5 μL。PCR擴(kuò)增條件（外顯子1）：95℃預(yù)變 性 4 min，94℃ 變 性 30 s，56.3℃ 退 火 30 s，72℃延伸20 s，33個循環(huán)，72℃再延伸8 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增條件（外顯子2）：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，51.2℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個循環(huán)，72℃再延伸8 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將上述PCR產(chǎn)物擴(kuò)增純化后送到英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 PCR-RFLP分析 酶切反應(yīng)體系為20 μL：限制性內(nèi)切酶 Hpy 99I 0.5 μL，10×Buffer 2 μL，PCR 產(chǎn) 物 17.5 μL，65℃水浴15 min，酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠成像系統(tǒng)判斷酶切結(jié)果并進(jìn)行基因分型。

1.5 統(tǒng)計分析 根據(jù)PCR-RFLP檢測結(jié)果，對不同基因型個體進(jìn)行統(tǒng)計，用以數(shù)據(jù)分析。利用Pop Gene 32統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2獨立性檢測、基因純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）分析；使用SPSS 24.0軟件中GLM程序?qū)Σ煌蛐烷g生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 對麥洼、申扎和類烏齊牦牛GPR41基因外顯子1、2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的片段大小一致（圖1、圖2），特異性良好，可用于后續(xù)實驗。

圖1 3個牦牛類群GPR41基因外顯子1 PCR擴(kuò)增

圖2 3個牦牛類群GPR41基因外顯子2 PCR擴(kuò)增

2.2 GPR41基因測序和PCR-RFLP分析結(jié)果 在3個牦牛類群GPR41基因外顯子1區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)突變位點；在麥洼牦牛GPR41基因外顯子2區(qū)域也未發(fā)現(xiàn)SNPs，而申扎和類烏齊牦牛GPR41基因外顯子2區(qū)發(fā)現(xiàn)1個突變位點，在4 570 bp處（與原序列相比），堿基由G突變?yōu)锳，編碼氨基酸未發(fā)生變化，屬同義突變。對申扎和類烏齊牦牛GPR41基因外顯子2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶Hpy 99I進(jìn)行酶切發(fā)現(xiàn)3種基因型，命名為AA、AG、GG（圖3）。

2.3 遺傳多態(tài)性分析

2.3.1 基因型頻率和基因頻率 由表2可知，申扎牦牛中，AA型基因型數(shù)目最多，屬于優(yōu)勢基因型，A為優(yōu)勢基因。類烏齊牦牛中，GG型為優(yōu)勢基因型，G為優(yōu)勢基因。GPR41基因在申扎牦牛中χ2值達(dá)到極顯著水平，不符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01），推測該突變位點受到人工選擇、基因突變等因素影響；類烏齊牦牛群體中χ2值為3.784，符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。

表1 GPR41基因引物信息

表2 GPR41基因在3個牦牛品種中的基因型頻率和基因頻率

圖3 牦牛GPR41基因PCR-RFLP酶切圖

2.3.2 GPR41基因 Ho、He、Ne及 PIC 分析 由表 3可知，GPR41基因突變位點在2個牦牛類群上的PIC分別為0.37和0.28，均屬于中度多態(tài)，且申扎牦牛遺傳多樣性較類烏齊牦牛高。

表3 2個牦牛品種GPR41基因遺傳多態(tài)性參數(shù)

2.4 GPR41基因不同基因型與生長性狀關(guān)聯(lián)分析 由表4可知，GPR41基因不同基因型對申扎牦牛體重和體高有顯著影響，且GG型均顯著高于AA型（P＜0.05）；而GPR41基因不同基因型與類烏齊牦牛各體尺性狀不相關(guān)（P＞0.05）。

3 討 論

GPR41是孤兒型G蛋白偶聯(lián)受體家族中的成員，它是短鏈脂肪酸的受體蛋白，能夠參與調(diào)控多種生理功能。有研究者發(fā)現(xiàn)，在山羊原代乳腺上皮細(xì)胞中，GPR41可顯著上調(diào)乳脂代謝相關(guān)基因 SREBP1、PPARG、INSIG-1、FABP3、SCD1的表達(dá)，從而影響乳腺脂代謝[11]。通過建立表達(dá)GPR41受體的細(xì)胞株參與丁酸誘導(dǎo)的生化生理過程，發(fā)現(xiàn)GPR41對丁酸酯的抗增殖、促凋亡作用有抑制作用，可知GPR41與組蛋白乙?；嚓P(guān)，可能參與細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期等乙?；嚓P(guān)調(diào)控[12]。組織表達(dá)方面，GPR41在人體回腸和結(jié)腸等組織中表達(dá)[13]；另外，在大鼠、兔、山羊、豬等物種的腦、心臟、脾臟、脂肪和結(jié)腸中也發(fā)現(xiàn)了GPR41的表達(dá)[14-17]。迄今為止，對于GPR41基因的研究主要集中在細(xì)胞和脂質(zhì)調(diào)控功能以及組織表達(dá)方面，而GPR41基因多態(tài)性與體尺性狀關(guān)聯(lián)性的研究僅有1篇報道。隨著中國肉牛產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，盡快縮短牦牛與肉牛產(chǎn)業(yè)的差距，尋找優(yōu)良合適的分子育種輔助標(biāo)記變得尤為重要。

本研究在申扎牦牛和類烏齊牦牛GPR41基因外顯子2區(qū)域發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點，第4570位（與原序列相比）發(fā)生堿基G→A突變，為同義突變。與王永安[18]在黃牛品種中發(fā)現(xiàn)的GPR41基因A498G突變位點存在差異，可能與牦牛自身的遺傳背景有關(guān)。通過酶切檢測發(fā)現(xiàn)共有AA、AG和GG 3種基因型。而在麥洼牦牛中僅檢測到GG型，可能是其他幾種基因型由于頻率過低而沒有在所選定的牦牛群體中出現(xiàn)，還可能因選擇的樣本量較小，受隨機(jī)遺傳漂變影響所致。χ2適應(yīng)性檢測顯示，申扎牦?；蛐头植疾环螲ardy-Weinberg平衡，可能受遺傳漂變或人工選育等因素影響；類烏齊牦牛處于Hardy-Weinberg平衡。PIC分析表明，申扎和類烏齊牦牛均表現(xiàn)為中度多態(tài)，說明這2個品種都具有選育潛力。通過分析不同基因型與牦牛生長指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性可知，GPR41基因突變位點不同基因型對申扎牦牛體重和體高有顯著性影響，而該位點的多態(tài)性與類烏齊牦牛的生長指標(biāo)無明顯相關(guān)性。本研究中同一SNP多態(tài)性對不同牦牛群體中各項生長指標(biāo)影響有所差異，可能因為不同品系之間的遺傳背景存在差異，還可能與選擇的樣本量較少有關(guān)。今后的育種工作中，需要擴(kuò)大群體數(shù)量、開展較大規(guī)模的屠宰及肉品質(zhì)測定研究，進(jìn)一步確定GPR41基因與生長性狀的相關(guān)性，以便加快牦牛品種的選育工作。

表4 2個牦牛品種GPR41基因不同基因型對體尺性狀的影響

4 結(jié) 論

GPR41基因在申扎和類烏齊牦牛中均存在較豐富的遺傳多態(tài)性，牦牛GPR41基因外顯子2區(qū)域存在多態(tài)位點，可作為GPR41基因多態(tài)性研究的參考資料；GPR41基因不同基因型對申扎牦牛體重和體高有顯著性影響，G4570A基因座可為今后牦牛育種過程中生長性狀分子標(biāo)記輔助選擇提供參考。