徐慶磊，Serafino M.A.Augustino，米思遠，王雅春，黃錫霞，張 勤，俞 英*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，北京 100193）

仔豬腹瀉常導致仔豬生長發(fā)育停滯、飼料報酬低、成活率降低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失[1]。有研究表明，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起新生和斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌，其中F4型ETEC是危害最大的致病菌之一[2]。仔豬對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4（ETEC F4）的抗性或易感是由大腸桿菌黏附素性菌毛能否黏附到小腸上皮細胞表面的受體上決定的，其通過釋放腸毒素引起水鹽代謝紊亂進而導致腸腔內(nèi)積液引發(fā)腹瀉[3]。因此，研究控制ETEC F4的受體基因，有助于開展豬分子抗病育種工作，選育出F4型大腸桿菌腹瀉抗性豬。

Fu等[4]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選到可能編碼ETEC F4受體蛋白的候選基因整合素β5（ITGB5）、黏蛋白13（MUC13）等。牛曉艷等[5]發(fā)現(xiàn)，豬ITGB5基因上3個SNP與仔豬腹瀉顯著相關(guān)。王文文[6]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除ITGB5基因后，發(fā)現(xiàn)該基因缺失顯著降低黏附到小腸上皮細胞上的 ETEC數(shù)目，而過表達會增加細菌黏附數(shù)。截止到目前為止，沒有關(guān)于ITGB5基因在抗性和易感豬的表達差異的報道。

本實驗利用熒光定量PCR技術(shù)檢測ITGB5和MUC13基因在仔豬ETEC F4抗性和易感個體間的差異表達情況以及在不同組織間的表達差異，驗證ITGB5和MUC13基因作為ETEC F4候選受體基因的功能，進而為選育出ETEC F4抗性豬提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗所用動物為中國農(nóng)科院實驗動物場飼養(yǎng)的大白仔豬，所有仔豬飼養(yǎng)于相同環(huán)境。在35日齡屠宰189頭大白仔豬并采集其小腸、脾臟、肺臟、胸腺、肝臟和淋巴，現(xiàn)場液氮保存，之后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱儲存。提取RNA所用試劑Trizol Reagent購自Ambion（美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa（大連），熒光定量試劑盒購自Roche（德國）。

1.2 黏附實驗和基因分型 首先在屠宰后2 h內(nèi)收集約10 cm的空腸段，沿其縱軸切開，并用低滲EDTA溶液（5 mmol/L，pH 為7.4）清洗。用顯微鏡載玻片刮擦空腸組織的黏膜表面，并經(jīng)后續(xù)處理制備得到小腸上皮細胞。將小腸上皮細胞刷狀緣細胞懸浮液和ETEC F4懸浮液（各0.1 mL）與0.4 mg/mL甘露糖混合，并在室溫下孵育30 min。顯微鏡觀察細菌黏附情況，根據(jù)黏附到小腸上皮細胞上的細菌個數(shù)將49頭ETEC F4不黏附的仔豬劃分為ETEC F4抗性群體，而小腸上皮細胞與ETEC F4黏附的140頭仔豬劃分為ETEC F4易感群體，這項工作已經(jīng)由本課題組其他成員在前期完成[7]。本實驗同時對前期通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）找到的與ETEC F4黏附表型顯著關(guān)聯(lián)且位于ITGB5基因和MUC13基因內(nèi)部的SNP進行基因分型。首先提取小腸組織基因組DNA，分別針對ITGB5基因和MUC13基因的SNP，利用Primer 6和Oligo 6軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。PCR擴增體系為25 μL：金牌Mix 22 μL，上、下游引物各 1 μL（10 nmol/μL），DNA 模板 1 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，30個循環(huán)；72℃ 2 min。隨機選擇黏附和非黏附個體的PCR擴增產(chǎn)物進行Sanger雙向測序并進行基因分型。綜合黏附表型與基因分型的結(jié)果，最終得到抗性和易感全同胞仔豬各4頭用于后續(xù)檢測基因表達量。

表1 SNP分型和熒光定量引物序列

1.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 Trizol法提取小腸、脾臟、肺臟、胸腺、肝臟和淋巴6個組織的總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，使用NANODROP 2000超微量分光光度儀測定RNA濃度和純度，-80℃冰箱保存。以總RNA為模板，按照試劑盒說明反轉(zhuǎn)成cDNA。具體反應(yīng)程序：① 5× gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL， 總 RNA 1 μg，RNase Free ddH2O補足體系至 10 μL，反應(yīng)條件為42℃ 2 min或室溫 5 min；② 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4 μL，Prime-Script RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL， ① 中反應(yīng)體系 10 μL，RNase free ddH2O 4 μL，總體積 20 μL，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.4 實時熒光定量PCR 參照NCBI數(shù)據(jù)庫中ITGB5基因mRNA序列（登錄號：NM_001246669.1）和MUC13基因mRNA序列（登錄號：NM_001105293.1），利用Primer 6和Oligo 6軟件設(shè)計熒光定量引物，并以GAPDH和β-actin作為內(nèi)參基因。引物信息見表1，引物交由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。以小腸等6個組織的cDNA為模板，配置反應(yīng)體系：Blue-SYBRGreen mix 10 μL，F(xiàn)orward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，模板 cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，總反應(yīng)體積 20 μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸 10 s，變性到延伸45 次循環(huán)；熔解曲線形成程序：95℃ 5 s，65℃ 1 min，97℃ 10 s，40℃ 10 s。利用 2-ΔΔCt公式計算基因的相對表達量，每個樣本3次重復(fù)，取平均值用于擴增效率的檢測，并分析熔解曲線。

1.5 統(tǒng)計分析 使用SPSS 23.0軟件對表達量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，結(jié)果用平均值±標準差表示，用單因素方差分析比較ITGB5和MUC13基因在6個組織中的表達量差異，用t檢驗分析抗性和易感個體的組間差異性。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ETEC F4抗性與易感個體的篩選 根據(jù)黏附表型選擇黏附和非黏附個體，并對于黏附表型顯著關(guān)聯(lián)且位于ITGB5基因和MUC13基因內(nèi)部的SNP進行基因分型。如圖1所示，ITGB5基因在g.135577826位點存在T/C突變位點，并且T對C為顯性，即CC基因型個體對大腸桿菌 F4 菌株表現(xiàn)為抗性，TT基因型個體表現(xiàn)為易感；MUC13基因在g.135435490位點存在A/G突變位點，且A對G為顯性，即GG基因型個體對大腸桿菌 F4 菌株表現(xiàn)為抗性，AA基因型個體表現(xiàn)為易感。結(jié)合黏附表型的結(jié)果，最終得到基因純合型抗性和易感全同胞仔豬各4頭。

圖1 ITGB5和MUC13基因遺傳變異位點測序圖

2.2 ITGB5和MUC13基因在大白仔豬不同組織中的表達譜 如圖2所示，ITGB5基因在不同組織中均有所表達，其中在肺臟中高度表達，并顯著高于小腸、淋巴、胸腺和肝臟（P＜0.05），在脾臟中表達量較高，顯著高于小腸和淋巴（P＜0.05），而在小腸、淋巴、胸腺和肝臟中表達量較低；MUC13基因在小腸中高度表達，其表達量顯著高于脾臟、淋巴、胸腺、肝臟和肺臟（P＜0.05）。

圖2 ITGB5（A）和MUC13（B）基因在不同組織中的相對表達量

2.3 ITGB5和MUC13基因在ETEC F4抗性和易感大白仔豬的表達差異分析 針對ITGB5基因（圖3-A），在ETEC F4抗性個體的小腸組織中的表達量低于易感個體（P＞0.05）；ETEC F4抗性個體的肺臟組織中的表達量顯著低于易感個體（P＜0.05）。對于MUC13基因（圖3-B），其在ETEC F4抗性個體小腸組織和胸腺中的表達量均顯著高于易感個體（P＜0.05），而在其他組織中抗性和易感個體未見顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 ITGB5和MUC13基因在大白豬F4大腸桿菌抗性與易感型個體間的表達差異

2.4 候選基因相關(guān)分析及免疫相關(guān)基因在仔豬小腸組織中的表達差異分析 由圖4可見，IL-6基因在抗性個體中的表達量低于易感個體，其余免疫相關(guān)基因IL-8、TNF-α、NF-κB在抗性個體中的表達量均高于易感個體，但均未達到統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

圖4 免疫相關(guān)基因在抗性和易感大白仔豬的表達量差異分析

3 討 論

3.1 仔豬腹瀉抗性相關(guān)基因ITGB5和MUC13的組織表達差異 本研究檢測ITGB5和MUC13基因的組織表達情況發(fā)現(xiàn)，ITGB5在不同組織中均有不同程度表達，其中在肺臟中高度表達，在脾臟組織中度表達，而在小腸、淋巴、胸腺和肝臟中表達量較低。整合素αvβ3與ITGB5基因編碼的整合素αvβ5同屬于整合素家族，整合素αvβ3廣泛表達于內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞等[8]，而肺臟中含有微血管內(nèi)皮細胞以及脾臟中含有大量的巨噬細胞，這也可能是ITGB5基因在肺臟和脾臟中表達量較高的原因。MUC13基因在小腸中高度表達，在脾臟、淋巴、胸腺、肝臟和肺臟中表達量較低或幾乎不表達。欽偉云等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MUC13基因在梅山斷奶仔豬的十二指腸和空腸中高度表達，這與本研究結(jié)果一致。上皮細胞表面分泌的黏蛋白在抵抗腸道致病菌感染中起重要作用，因此MUC13基因在小腸中高度表達，其編碼的黏蛋白可能與致病性大腸桿菌發(fā)生互作，阻止致病菌結(jié)合糖蛋白分子，從而降低了黏附到小腸上皮細胞的細菌數(shù)，提高了機體的抵抗力。

3.2 ITGB5和MUC13基因在腹瀉抗性和易感大白仔豬間的表達差異分析 本實驗檢測發(fā)現(xiàn)，ITGB5基因在抗性個體小腸中的表達量低于易感個體，這說明ITGB5基因的低表達水平可能有助于防御F4型ETEC對仔豬小腸上皮細胞的侵襲，該基因在仔豬腹瀉抗性調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，MUC13基因在抗性個體小腸中的表達量顯著高于易感個體。針對MUC13基因在抗性和易感個體中的表達量差異，前人的研究結(jié)果不一。Schroyen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MUC13基因在抗性個體中的表達量顯著高于易感個體，與本研究結(jié)果一致。而楊懷谷[11]研究發(fā)現(xiàn)，在蘇太豬與杜×長×大三元雜交商品豬中，MUC13基因在不同黏附表型個體中的表達無顯著性差異；Sinha等[12]研究印度本地豬種不同黏附表型個體的MUC13基因在空腸表達的差異性時發(fā)現(xiàn)，MUC13基因在黏附豬個體和不黏附個體的表達量未達到顯著性差異。這可能是由于豬種不同導致實驗結(jié)果不一致。

針對MUC13基因分型結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為抗性個體的GG型為野生型，表現(xiàn)為易感個體的AA型為突變型，而針對ITGB5的基因分型與之相反。結(jié)果提示，突變型個體小腸中MUC13基因的低水平表達，可能導致其編碼的小腸上皮細胞表面的黏蛋白不能有效阻止致病性大腸桿菌結(jié)合糖蛋白分子，進而使黏附到小腸上皮細胞的細菌數(shù)增加，仔豬表現(xiàn)為對致病性大腸桿菌易感。在抗性個體和易感個體中ITGB5基因的表達量盡管沒有顯著性差異，但ITGB5基因在抗性個體的表達量明顯高于易感個體，而MUC13基因內(nèi)部的SNP位點可能是調(diào)節(jié)突變，但它們是否為ETEC F4 受體基因真正的因果突變還需進一步確定。

3.3 ITGB5和MUC13基因與仔豬腹瀉的關(guān)系 課題組前期通過GWAS發(fā)現(xiàn)，ITGB5和MUC13基因是仔豬腹瀉抗性的重要候選基因[4]。ITGB5基因編碼整聯(lián)蛋白的β亞基，整聯(lián)蛋白是參與細胞黏附的細胞表面受體，通過細胞表面介導細菌黏附的玻連蛋白，使整聯(lián)蛋白與致病菌黏附[13]。MUC13基因編碼的黏蛋白是由導管和腺上皮組織表達的分泌于細胞表面糖蛋白家族成員。有研究表明，MUC13基因編碼的蛋白對黏膜上皮具有保護和潤滑的作用，可以降低細胞與細胞及細胞外基質(zhì)的黏附[14-16]。ETEC F4黏附到ITGB5或MUC13基因可能編碼的受體蛋白上，感染小腸上皮細胞，往往能激活免疫反應(yīng)，導致免疫相關(guān)基因的表達量發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)在抗性和易感個體中免疫相關(guān)基因IL-6、IL-8、TNF-α、NF-KB均未見顯著性差異。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與未攻菌組相比，ETECs 感染后會引起豬小腸上皮細胞系IPEC-J2 細胞中免疫相關(guān)基因顯著上調(diào)。Devriendt等[18]同樣發(fā)現(xiàn)，ETEC F4感染 IPEC-J2 細胞均顯著增加IL-6 和IL-8 的表達。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，可能的原因是，在本試驗中根據(jù)黏附試驗得到黏附抗性和易感個體并檢測其免疫基因的表達量，與他人實驗設(shè)計方法不同，即實驗組對IPEC-J2 細胞系進行ETEC攻菌，對照組進行PBS處理不同，導致研究結(jié)果有區(qū)別。

基于本研究以及已報道的2個候選基因的功能，本研究提出候選基因?qū)4型ETEC的抗性調(diào)控假說。如圖5所示，致病性大腸桿菌通過玻連蛋白（Vn）的橋梁作用間接黏附到ITGB5基因編碼的整合素V5受體蛋白，引起“觸發(fā)”機制使致病菌定植到小腸上皮細胞并釋放腸毒素，激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，使細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）大量分泌，大量氯離子和水分子持續(xù)轉(zhuǎn)運入腸腔引發(fā)腹瀉；另一方面MUC13基因編碼的黏蛋白具有保護和潤滑腸道黏膜上皮并阻止或減少病原菌侵染的作用。因此，ITGB5和MUC13基因可能在抵御ETEC F4感染時均發(fā)揮作用，是ETEC F4引起仔豬腹瀉重要的抗性候選基因。

圖5 ETEC侵染仔豬小腸上皮細胞假說

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，ITGB5基因的低水平表達可能有助于抵抗F4型ETEC對仔豬小腸上皮細胞的侵襲；MUC13基因在小腸中高度表達，且在抗性個體中的表達量顯著高于易感個體，表明MUC13基因的高表達可能有助于降低致病菌黏附到小腸上皮細胞上，進而實現(xiàn)對致病性大腸桿菌的抗性。本實驗進一步驗證了仔豬腹瀉抗性候選基因ITGB5和MUC13的功能，這為仔豬抗腹瀉的育種工作提供了技術(shù)依據(jù)。