張翠彩，張汀蘭，徐建民，蔣秀高，邱海燕

鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)引起的人獸共患病，人類主要通過直接或間接接觸感染動物的尿液而感染，宿主動物包括嚙齒類動物(黑線姬鼠、黃毛鼠等)、家畜(豬、犬和牛等)，其中鼠類為鉤體病的主要宿主動物。

21世紀以來，全國鉤體病發(fā)病率、死亡率呈逐步下降態(tài)勢，近10年已處于較低水平，但局部地區(qū)仍然有報道存在小范圍的散發(fā)或者暴發(fā)疫情[1]。江西省作為鉤體病的老疫區(qū)，每年的發(fā)病率均位居全國前列，是江西省危害較大的急性傳染病之一。2016至2018年，全國(不含港澳臺地區(qū))共報告鉤端螺旋體病病例分別為354例、201例和157例，報告發(fā)病率分別為0.0258/10萬、0.0146/10萬和0.0113/10萬；而2016至2018年江西省共報告病例分別是19例、21例和9例，報告發(fā)病率分別為0.0416/10萬、0.0261/10萬和0.0195/10萬，3年的報告發(fā)病率均高于全國，因此，對鉤體病的宿主動物開展流行病學監(jiān)測，了解宿主動物種類構成、感染狀況及分離菌株病原學特征分析有助于鉤體病的流行病學溯源及疾病的預防控制。近年來多位點序列分析(Multilocus sequence typing，MLST)的分子分型方法，逐漸應用于病原菌分子分型、分子流行病學研究等。本研究于2016-2018年選擇4個江西省國家級鉤體病監(jiān)測點上饒縣、上高縣、上猶縣及浮梁縣作為監(jiān)測現(xiàn)場，對主要宿主動物鼠類構成及帶菌狀況開展流行病學監(jiān)測，并對分離菌株利用暗視野顯微鏡凝集試驗進行血清群鑒定，利用MLST 方法對其進行基因分型研究，初步了解江西省鼠密度、帶菌率及分離菌株的血清學、分子流行病學特征，為江西省鉤體病預防控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1捕鼠方法 選取江西省鉤體病高發(fā)的四個國家級監(jiān)測點上饒、上高、上猶及浮梁縣鉤體疫區(qū)稻田環(huán)境作為現(xiàn)場監(jiān)測地點，于2016-2018年每年4-6月、9-11月采取夾夜法開展鼠類種類構成、鉤體病病原學監(jiān)測調(diào)查。每個監(jiān)測點每次放置有效鼠夾數(shù)≥300夾，行距30 m，夾距5 m，鼠夾大約為40×12×12 cm。每次天黑前放夾，次日凌晨收夾。參考《醫(yī)學動物分類鑒定》對捕獲鼠類進行鼠種鑒定，計算鼠密度。

1.2鉤體病原分離培養(yǎng) 無菌解剖操作，取米粒大小鼠腎組織接種到10 mL EMJH培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，采用暗視野顯微鏡觀察有無鉤體疑似菌株生長。

1.3主要試劑 15群15型鉤體參考菌株診斷血清購自中國食品藥品檢定研究院；基因組提取選用北京賽百盛基因技術有限公司硅膠膜型TM基因組DNA提純試劑盒；PCR Premix購自大連寶生物工程(大連)有限公司；100 bp DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司。

1.4分離菌株血清群鑒定 利用中國15群15型鉤體參考菌株免疫兔血清，采用暗視野顯微鏡凝集試驗(MAT)，對分離鉤體菌株進行血清學鑒定，在暗視野顯微鏡下觀察凝集結果，以出現(xiàn)50%菌體凝集的血清群為最終鑒定血清群。

1.5分離菌株基因組提取 分離菌株在EMJH鉤體液態(tài)培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)7～10 d，達到對數(shù)生長期后提取基因組DNA，操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.6MLST基因分型 參考文獻中的MLST方案[2]，利用7個位點pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB進行PCR擴增，各位點詳細信息見表1，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。利用20 μL反應體系，cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Premix Ex Taq10.0 μL，純水補充至20 μL反應體積。PCR 擴增程序如下：95 ℃ 預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行純化、雙向測序，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。將每株分離株7個位點序列與MLST網(wǎng)站http://pubmlst.org/上相應等位基因進行比較，獲得每株分離菌株的等位基因譜(gluM-pntA-sucA-tpiA-pfkB-mreA-caiB)以及ST型別。利用BioNumerics軟件進行聚類分析，觀察分離菌株間的基因多態(tài)性及種群結構。

表1 MLST分析中7個位點引物信息
Tab.1 Primers of seven loci in MLST analysis

位點引物序列 (5′ to 3′)PCR產(chǎn)物大小/bppntAF-TAGGAAARATGAAACCRGGAACR-AAGAAGCAAGATCCACAAYTAC621sucAF-TCATTCCACTTYTAGATACGATR-TCTTTTTTGAATTTTTGACG640pfkBF-CGGAGAGTTTTATAARAAGGACATR-AGAACACCCGCCGCAAAACAAT588tpiAF-TTGCAGGAAACTGGAAAATGAATR-GTTTTACRGAACCHCCGTAGAGAAT639mreAF-GGCTCGCTCTYGACGGAAAR-TCCRTAACTCATAAAMGACAAAGG719gluMF- AGGATAAGGTCGCTGTGGTAR- AGTTTTTTTCCGGAGTTTCT650caiBF-CAACTTGCGGAYATAGGAGGAGR-ATTATGTTCCCCGTGAYTCG650

2 結 果

2.1 鼠類種類構成及帶菌監(jiān)測

2.1.1鼠種分布及分離鉤體菌株情況 2016-2018年在江西省上饒縣、上高縣、浮梁縣及上猶縣共布置鼠夾14 387只，共計捕鼠1 404只，平均鼠密度為9.76%，分離菌株64株，鼠類鉤體分離率為4.56%; 鼠種構成包括黑線姬鼠、褐家鼠、黃毛鼠、黃胸鼠及社鼠5個種類。4個監(jiān)測點優(yōu)勢鼠種均以黑線姬鼠和黃毛鼠為主。從鉤體菌株分離結果顯示，浮梁縣的分離菌株來自黑線姬鼠；上饒縣和上猶縣菌株均來自黑線姬鼠和黃毛鼠，而上高縣未分離到鉤體菌株，浮梁縣的鉤體分離率高于其他2個縣，為10.56%，具體見表2。

2.1.2血清群鑒定 經(jīng)MAT試驗結果顯示：64株江西省致病性鉤體分離株隸屬于3個血清群，分別是黃疸出血群、爪哇群和致熱群。其中黃疸出血群為江西省主要優(yōu)勢血清群，占81.25%(52/64)，其次依次為爪哇群占17.19%(11/64)和致熱群占1.56%(1/64)。不同地區(qū)的優(yōu)勢血清群分布存在一定程度地域差異，浮梁和上饒地區(qū)全部為黃疸出血群，上猶地區(qū)以爪哇群為主，占84.62%(11/13)，其次為致熱群和黃疸出血群，詳見圖1。

圖1 2016-2018年64株江西省鉤端螺旋體菌株血清群構成Fig.1 Numbers of Serogroup for 64 Leptospira strains isolated from Jiangxi during 2016-2018

表2 2016-2018年江西省國家級鉤體病監(jiān)測點鼠種分布及分離菌株情況
Tab.2 Rodent distribution and strains isolated from rodent during 2016-2018 in four national monitoring sites of leptospirosis in Jiangxi

監(jiān)測點布夾數(shù) 捕鼠數(shù)鼠密度(%)分離菌株分離率(%)鼠種分布及分離菌株情況黑線姬鼠褐家鼠黃胸鼠黃毛鼠社鼠上饒縣2 66442515.95194.4716/2990/00/403/740/12上高縣3 8443158.19000/2140/260/200/550/0浮梁縣4 8863036.203210.5632/2530/160/110/170/6上猶縣2 99336112.06133.608/2280/00/55/1280/0合計14 38714049.76644.5656/9940/420/768/2740/18

2.2 MLST分型結果

2.2.1基因多態(tài)性分析 MLST分析結果顯示，64株致病性鉤體呈現(xiàn)6個ST型別，主要優(yōu)勢ST型別是ST1，占76.56%(49/64)，其次依次是ST143占15.62%(10/64)、ST17占3.13%(2/64)、ST92占1.56%(1/64)、ST224占1.56%(1/64)和ST216占1.56%(1/64)。不同地區(qū)的優(yōu)勢ST型分布也存在一定程度的地域差異，上猶地區(qū)以ST143為主，浮梁和上饒地區(qū)以ST1為主，詳見圖2。

圖2 2016-2018年64株江西省鉤端螺旋體菌株ST型別情況Fig.2 Numbers of sequence types (STs) for 64 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province during 2016-2018

2.2.2BioNumerics軟件分析結果 采用UPGMA聚類分析顯示：64株菌株共分為6個Cluster群，分別對應6種ST型，見圖3。Cluster1對應ST216，僅包括1株2016年上猶菌株；Cluster2對應ST92，僅包括1株2018年上猶菌株；Cluster3對應ST17，來自2017年上饒菌株；Cluster4對應ST224，僅包括1株2016年上猶菌株；Cluster5對應ST1，為江西省的優(yōu)勢克隆群，包括2016-2018年17株上饒和2016、2018年32株浮梁菌株；Cluster6對應ST143，包括10株2016年上猶菌株。由聚類圖顯示：ST型別分布地域差異明顯，上饒地區(qū)包括ST1和ST17兩種型別，浮梁僅包括ST1一種型別，上猶地區(qū)基因型別相對豐富，13株菌株呈現(xiàn)ST92、ST143、ST224和ST216四種型別，以ST143為主，占76.92%(10/13)。ST型別宿主分布存在一定程度差異。黑線姬鼠作為江西省的主要宿主，所分離菌株ST型別豐富，包括ST1、ST17、ST92、ST216和ST143五個ST型。黃毛鼠來源的分離菌株僅包括ST1、ST224和ST143三種ST型別。

圖3 2016-2018年64株江西省鉤端螺旋體UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA dendrogram of 64 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province during 2016-2018

3 討 論

嚙齒類動物作為鉤體病的重要宿主動物，在鉤體病的傳播、流行中起著重要作用。江西省是鉤體病的老疫區(qū)，地理環(huán)境復雜、氣候濕潤，嚙齒類動物豐富。本研究選取2016-2018年4個江西省國家級監(jiān)測點開展現(xiàn)場調(diào)查、病原分離、鑒定研究，共捕獲5種鼠種，4個監(jiān)測點均以黑線姬鼠和黃毛鼠為優(yōu)勢鼠種，鼠密度為9.76%。2011年李世軍報道貴州省錦屏、黎平和榕江縣鼠密度介于5.0%～12.7%之間，不同地區(qū)優(yōu)勢鼠種不同，錦屏縣以黑線姬鼠為主，黎平和榕江縣以高山姬鼠為主[2]。2018年徐國英報道福建省鼠密度為6.29%，優(yōu)勢鼠種以黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠和針毛鼠為主[3]。由此可見，不同省份的鼠密度稍有差異，并且優(yōu)勢鼠種也略有不同。本次江西省現(xiàn)場調(diào)查的鼠腎分離率偏低，為4.56%。巴西、新喀里多尼亞及馬來西亞有文獻報道鼠類鉤體分離率介于11.0%～80.3%之間[4-6]。本團隊對2002-2014年江西省鉤體病開展流行病學現(xiàn)場監(jiān)測，結果顯示鉤體分離率為9.35%[7]。有文獻報道福建、安徽及浙江地區(qū)鉤體分離率分別為0.76%、4.75%及1.61%[8-10]。由于鉤體的分離培養(yǎng)技術要求較高，要求鉤體液態(tài)培養(yǎng)基放置28 ℃孵箱內(nèi)培育，每隔5～7 d檢查有無鉤端螺旋體生長。若有生長，即為分離陽性。若未見生長，需繼續(xù)培養(yǎng)到60 d，仍不見鉤端螺旋體方作陰性處理。因此，鉤體的培養(yǎng)周期較長，采用的是液態(tài)培養(yǎng)基，而且頻繁鏡檢容易受到污染，故其檢出率較低。

本團隊對2002-2014年間江西省分離菌株進行血清群和MLST分析，結果顯示黃疸出血群、爪哇群和澳洲群為優(yōu)勢血清群，MLST分型結果顯示ST1、ST143、ST105、ST37和ST17為5個優(yōu)勢ST型別[7]。徐建民等利用PFGE分型技術對2002-2008年江西監(jiān)測菌株研究發(fā)現(xiàn)：黃疸出血群賴型、澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型是江西省人群及宿主動物中的優(yōu)勢型別[11]。本次研究顯示黃疸出血群和ST1為2016-2018年江西鼠類的優(yōu)勢型別，血清群和ST型別分布在江西省地域差異明顯，這可能與不同地區(qū)的地理位置、地形地貌、天氣、海拔等因素有關。據(jù)報道根據(jù)地理位置和地形地貌等特征，江西省分為5個不同的動物鉤體病地理流行病區(qū)域[7]。本次研究中分離到鉤體菌株的3個監(jiān)測點，隸屬于其中的2個不同地理流行病區(qū)域，浮梁和上饒?zhí)幱诮鳀|北部丘陵地帶，平均海拔在100～300 m左右；而上猶處于江西省西南部高原地區(qū)，森林植被豐富，適宜嚙齒類動物生存，平均海拔在1 000～1 600 m左右。本次研究中2016-2018年江西省鉤體病優(yōu)勢流行型別，與本團隊對2002-2014年江西調(diào)查及徐建民等對2002-2008年的江西調(diào)查結果一致，這提示近年來江西省鉤體病主要流行血清群和ST型別變化不大。李世軍等對2007-2009年貴州菌株研究發(fā)現(xiàn)：3株分離株鑒定為黃疸出血群和ST1型別[12-13]。王亞琳等報道2010年四川樂至人間鉤體疫情主要致病血清群為是黃疸出血群[1]。綜上所述，江西省鉤體病主要流行型別與中國四川、貴州等其他地區(qū)型別一致。

嚙齒類動物以及家畜是鉤體病的主要宿主動物，江西省是鉤體病老疫區(qū)，本次江西省鼠類鉤體病現(xiàn)場調(diào)查工作為江西省鉤體病的分子流行病學研究提供了科學依據(jù)。因此，在以后的工作中應繼續(xù)加強對嚙齒類動物的動態(tài)監(jiān)測，及時了解鉤體病疫區(qū)的鼠種構成、鼠密度、帶菌率及人間、宿主動物的感染型別，為江西省鉤體病的流行病學溯源以及疾病預防控制提供科學依據(jù)。

利益沖突：無