黃 浩，陳文江2，劉長(zhǎng)召，王 玲，王鳳萍

冠心病(coronary artery disease， CAD)主要是指冠狀動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化所導(dǎo)致的心臟疾病，給病人及家庭、社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)，尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，為CAD中最嚴(yán)重的類型，其發(fā)病率逐年升高，為臨床常見(jiàn)的心血管疾病之一，具有較高的死亡率和致殘率[1-2]。據(jù)我國(guó)最新心血管疾病報(bào)告顯示：我國(guó) AMI 死亡率城市為 55.32/10萬(wàn)人， 農(nóng)村為68.60/10 萬(wàn)人，而AMI 死亡率均隨年齡的增高而增加，由此可見(jiàn)其防治顯得十分重要[3-4]。目前，對(duì)于AMI的防治主要是對(duì)危險(xiǎn)因素(高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、肥胖、大氣污染和不合理膳食等)的控制和早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療[5]。關(guān)于AMI的診治，目前主要依靠于臨床癥狀、心電圖和心肌酶譜等綜合評(píng)估，然而我國(guó)AMI病人的診治普遍較晚，從入院到接受急診再灌注治療時(shí)間存在很大的差異，入院到接受急診冠狀動(dòng)脈介入治療的中位時(shí)間為 165 min，從入院到溶栓時(shí)間為 130 min，主要可能與醫(yī)院硬件設(shè)施和診斷標(biāo)志物水平檢測(cè)等有關(guān)。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)了一些新型的AMI生物診斷標(biāo)志物，如超敏C反應(yīng)蛋白、脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2、血清卵泡抑素樣蛋白1和循環(huán)微小RNA(microRNA， miRNA)等[6-9]，尤其是循環(huán)miRNA(主要是指血清、血漿和尿液等中的miRNA)與AMI的研究成為熱點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等[10-15]均可能與AMI發(fā)病密切相關(guān)，并可作為AMI的診斷標(biāo)志物，然而各個(gè)研究納入人群(種族、年齡和病史等)、樣本量和檢測(cè)方法等都不同，因而結(jié)論也尚未達(dá)成一致，還有待進(jìn)一步研究。本研究擬對(duì)血漿hsa-miR-19a-3p進(jìn)行檢測(cè)，探討其與AMI的相關(guān)性，并與傳統(tǒng)心肌標(biāo)志物進(jìn)行比較分析，以期發(fā)現(xiàn)更有效的心肌損傷診斷標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選2015年5月—2016年10月CAD病人90例作為研究對(duì)象，其中AMI組45例，穩(wěn)定型冠心病(SCAD)組45例，所有病人于入院6 h內(nèi)以EDTA抗凝管抽取2 mL 靜脈血；另外，對(duì)行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)術(shù)的AMI病人在術(shù)后1 d和3 d各收集2 mL 靜脈血，并于4 h內(nèi)進(jìn)行離心(3 000 r/min，4 ℃，10 min)分離血漿，保存于-80℃冰箱，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。同時(shí)，收集病人入院時(shí)基本病史和生化檢測(cè)指標(biāo)等臨床資料。

1.2 CAD診斷標(biāo)準(zhǔn) 按照《中國(guó)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療指南(2016)》[16]進(jìn)行診斷和分類。入選標(biāo)準(zhǔn)[9]：經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影(CAG)證實(shí)3支主要冠狀動(dòng)脈中至少一支冠狀動(dòng)脈管腔狹窄>50%；行急診PCI的AMI病人；心電圖和傳統(tǒng)心肌標(biāo)志物符合AMI診斷。SCAD包括以下3類病人：慢性穩(wěn)定性勞累型心絞痛；既往已明確診斷有冠心病或者最近發(fā)生休息時(shí)心絞痛，但經(jīng)治療后疼痛消失，需定期隨訪的穩(wěn)定病人(包括變異型心絞痛、低危不穩(wěn)定型心絞痛、微血管性心絞痛)；無(wú)癥狀或者有“缺血相當(dāng)”癥狀(氣急、左心室功能不全等)的缺血性心臟病病人。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 惡性腫瘤、腦卒中、外周血管疾病、肝腎功能不全、急性感染及患其他慢性器質(zhì)性疾病病人。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè) 采用ELISA測(cè)定血漿肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌紅蛋白(MYO)和肌鈣蛋白I(cTnI)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行相關(guān)具體步驟檢測(cè)。

1.5 血漿hsa-miR-19a-3p的qRT-PCR檢測(cè) 采用miRNAcute miRNA提取分離試劑盒(廣州真知生物有限公司)柱式分離提取并純化其miRNA，然后按照其配套的miRNAcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(廣州真知生物有限公司)將miRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后按照miRNAcute miRNA SYBR Green熒光定量檢測(cè)試劑盒(廣州真知生物有限公司)及試劑盒中的下游引物進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。hsa-miR-19a-3p(MIMAT0000073，UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA)的上游引物和內(nèi)參U6引物(廣州真知生物有限公司提供)，下游引物為試劑盒通用引物。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，熒光定量過(guò)程：94 ℃變性2 min；PCR循環(huán)中模板94 ℃變性20 s；60 ℃退火、延伸34 s；共30個(gè)循環(huán)。本研究采用2-ΔCt相對(duì)定量方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)=Ct(實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因)-Ct(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)；ΔCt(對(duì)照組)=Ct(對(duì)照組目標(biāo)基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參)。

2 結(jié) 果

2.1 入選研究人群基本特征情況 本研究共納入90例研究對(duì)象，兩組研究對(duì)象在年齡、性別、吸煙史、高血壓等基本病史方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在β受體阻滯劑等基本心血管相關(guān)藥物服用方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；入院時(shí)血清肌酐和血糖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AMI組的脂蛋白a、總膽固醇和低密度脂蛋白與SCAD組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AMI組心肌標(biāo)志物CK-MB 、MYO、cTnI與SCAD組比較明顯升高(P<0.000 1)。詳見(jiàn)表1。

表1 入選研究人群基本病史和生化檢查情況比較

注：BMI為體質(zhì)指數(shù)；CCB為鈣通道阻滯劑；ACEI為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑；ARB為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑

2.2 血漿中hsa-miR-19a-3p表達(dá)與CK-MB、MYO、cTnI的相關(guān)性 AMI組血漿hsa-miR-19a-3p水平(0.20±0.02)較SCAD組(0.05±0.01)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1A。經(jīng)過(guò)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：血漿hsa-miR-19a-3p的表達(dá)水平與CK-MB的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.488 1，95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)為0.312 5～0.631 4(P<0.000 1)。詳見(jiàn)圖1B。與MYO的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.457 0，95%CI為0.275 9，0.606 7(P<0.000 1)。詳見(jiàn)圖1C。與cTnI的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.452 2，95%CI為0.270 3～0.602 8(P<0.000 1)。詳見(jiàn)圖1D。

圖1 血漿hsa-miR-19a-3p表達(dá)及其與CK-MB 、MYO、cTnI的相關(guān)性

2.3 血漿hsa-miR-19a-3p、CK-MB 、MYO和cTnI的ROC曲線 血漿hsa-miR-19a-3p的 ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)=0.895 3，95%CI(0.825 1，0.965 6)，P<0.000 1。詳見(jiàn)圖2A。CK-MB的AUC=0.854 8，95%CI(0.774 7，0.934 9)，P<0.000 1。詳見(jiàn)圖2B。MYO的 ROC曲線的AUC=0.932 3，95%CI(0.881 6，0.983 1)，P<0.000 1。詳見(jiàn)圖2C。cTnI的ROC曲線的AUC=0.948 6，95%CI(0.901 6，0.995 7)P<0.000 1。詳見(jiàn)圖2D。hsa-miR-19a-3p截?cái)嘀?cut-off)為 0.029 8，其靈敏度為44.44%(29.64%～60.00%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；CK-MB的cut-off值為1.884 U/L，其靈敏度為22.22%(11.20%～37.09%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；MYO的cut-off值為4.927 ng/mL，其靈敏度為53.33%(37.87%～68.34%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；cTnI的cut-off值為2.897 ng/L，其靈敏度為57.78%(42.15%～72.34%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)。

2.3 AMI病人PCI術(shù)前、術(shù)后血漿中hsa-miR-19a-3p表達(dá)情況 對(duì)AMI病人行PCI術(shù)前、術(shù)后1 d及術(shù)后3 d血漿中hsa-miR-19a-3p分析發(fā)現(xiàn)，PCI術(shù)前血漿hsa-miR-19a-3p的表達(dá)(0.245 7±0.028 1，n=45)與術(shù)后1 d(0.195 0±0.026 1，n=42)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而術(shù)后3 d血漿hsa-miR-19a-3p的表達(dá)(0.071 1±0.008 9，n=40)較術(shù)前比較則明顯下降(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3。

圖2 血漿hsa-miR-19a-3p、CK-MB 、MYO和cTnI的ROC曲線

與術(shù)后3 d比較，*P<0.05

2.4 AMI病人血管病變支數(shù)與血漿hsa-miR-19a-3p表達(dá)情況比較 本研究共納入AMI病人45例，經(jīng)過(guò)CAG和PCI發(fā)現(xiàn)，其中冠狀動(dòng)脈單支病變病人17例，雙支病變病人16例，而三支病變病人12例，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)：三支病變病人血漿中hsa-miR-19a-3p表達(dá)(0.130 4±0.007 3)，明顯比雙支病變(0.213 3±0.038 4)和單支病變(0.269 8±0.051 4)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；且雙支病變病人hsa-miR-19a-3p表達(dá)水平與單支病變病人比較也明顯升高(P<0.000 1)。詳見(jiàn)圖4。

與單支病變比較，*P<0.000 1；與雙支病變比較，#P<0.000 1

3 討 論

miRNA為一類長(zhǎng)約22個(gè)堿基的非編碼RNA，目前研究發(fā)現(xiàn)，大量miRNA廣泛參與生物體的各種生理過(guò)程和病理過(guò)程，大量miRNA可能參與了心血管系統(tǒng)的發(fā)育和心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。AMI為危害人類健康的災(zāi)難性疾病，其防治隨著近年來(lái)診治水平(PCI和溶栓治療)的開展取得了顯著成效，然而我國(guó)AMI發(fā)病率和死亡率仍然呈逐年升高的趨勢(shì)，因而對(duì)AMI防治研究仍然十分重要。隨著miRNA研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等都可能與心血管疾病密切相關(guān)，尤其是循環(huán)miRNA的發(fā)現(xiàn)，為miRNA的研究開辟了新方向。有研究表明大量循環(huán)miRNA可能與腫瘤系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和消化系統(tǒng)疾病等有關(guān)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等可以作為AMI的診斷生物標(biāo)志物[17-21]。然而，循環(huán)miRNA作為標(biāo)志物在臨床的應(yīng)用卻很少，主要是因?yàn)楦鱾€(gè)研究納入人群不同、采用檢測(cè)方法不同和檢測(cè)的miRNA也不一樣，所以導(dǎo)致循環(huán)miRNA的應(yīng)用未被推廣。雖然未被推廣，但是循環(huán)miRNA作為疾病診斷標(biāo)志物的研究仍具有前景，隨著大量研究的深入開展，有Meta分析顯示，miR-499對(duì)AMI的總體敏感性為88%[95%CI(0.86，0.90)，P<0.000 1]；特異性為0.87 [95%CI(0.84，0.90)，P<0.000 1]；miR-1對(duì)AMI的總體敏感性為63% [95%CI(0.59，0.66)，P<0.000 1]；特異性為76% [95%CI(0.71，0.80)，P<0.000 1]；miR-133a對(duì)AMI的總體敏感性為89%[95%CI(0.83，0.94)，P=0.004 7]；特異性為87%[95%CI(0.79，0.92)，P=0.026 2]；miR-208b對(duì)AMI的總體敏感性為78%[95%CI(0.76，0.81)，P=0.058 1]；特異性為88%[95%CI(0.84，0.91)，P<0.000 1]；說(shuō)明循環(huán)miRNA確實(shí)具有作為診斷疾病生物標(biāo)志物的潛能[22-23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，AMI組血漿hsa-miR-19a-3p水平較SCAD組明顯升高(P<0.05)，發(fā)現(xiàn)其與CK-MB的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.488 1(P<0.000 1)，與MYO的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.457 0(P<0.000 1)，與cTnI的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.452 2(P<0.000 1)；并發(fā)現(xiàn)血漿hsa-miR-19a-3p的AUC為0.895 3(P<0.000 1)，其靈敏度為44.44%(29.64%～60.00%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；CK-MB的AUC為0.8548(P<0.000 1)，靈敏度為22.22%(11.20%～37.09%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；MYO的AUC為0.932 3(P<0.000 1)，靈敏度為53.33%(37.87%～68.34%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)；cTnI的AUC為0.948 6(P<0.000 1)，其靈敏度為57.78%(42.15%～72.34%)，特異性為97.78%(88.23%～99.94%)，由此可見(jiàn)，血漿hsa-miR-19a-3p可能與AMI的發(fā)病有關(guān)，在AMI中呈現(xiàn)明顯差異性表達(dá)，而且可以作為AMI的診斷標(biāo)志物，具有較高特異性。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)血漿hsa-miR-19a-3p在PCI術(shù)后3 d明顯下降，可能具有判斷AMI病人預(yù)后的價(jià)值；通過(guò)冠狀動(dòng)脈主要血管病變數(shù)量分析發(fā)現(xiàn)，三支病變病人血漿中hsa-miR-19a-3p表達(dá)明顯比雙支病變和單支病變病人升高(P<0.000 1)；而且雙支病變病人hsa-miR-19a-3p表達(dá)水平與單支病變病人比較也明顯升高(P<0.000 1)，該結(jié)果說(shuō)明血漿hsa-miR-19a-3p的表達(dá)可能與AMI病人心臟血管病變數(shù)量有關(guān)，可能具有反映心臟病變程度的潛力。

然而，本研究只是一個(gè)小樣本的研究，還有待大樣本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證；而且發(fā)現(xiàn)血漿hsa-miR-19a-3p在AMI組和SCAD組的明顯差異性表達(dá)，然而其可能機(jī)制還未進(jìn)行探討和探究。本研究顯示，血漿hsa-miR-19a-3p作為AMI標(biāo)志物的敏感性較低，但是特異性并不低于傳統(tǒng)心血管心肌酶。隨著非編碼RNA研究的深入，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs， lncRNAs)和環(huán)狀RNA(Circular RNAs， circRNAs)等新型非編碼RNA也被發(fā)現(xiàn)，而且發(fā)現(xiàn)lncRNAs和circRNAs也與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，也發(fā)現(xiàn)了部分lncRNAs和circRNAs可以作為心血管疾病的診斷標(biāo)志物[24-27]，如果能夠結(jié)合miRNAs、lncRNAs和circRNAs共同來(lái)作為生物標(biāo)志物，可能具有更大意義，也可能揭示心血管疾病新的發(fā)病機(jī)制，為心血管防治開辟新途徑和新方法。

綜上所述，血漿hsa-miR-19a-3p可能與AMI發(fā)病密切相關(guān)，并可以作為AMI的新型診斷生物標(biāo)志物。