高謀 徐如祥 王文佳 董勤 丁柏勻 姚慧 楊志軍

補體系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，補體系統(tǒng)激活可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)介導顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）后炎癥反應，也可形成補體膜攻擊復合物（C5b-9）加重神經(jīng)細胞損傷[1,2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）內(nèi)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞可表達補體調(diào)節(jié)分子 Crry、Cd46、Cd59a和 Cd55，減輕補體活化介導的細胞損傷[3,4]。然而，由于神經(jīng)細胞選擇性低表達補體調(diào)節(jié)分子，因此其易遭受補體系統(tǒng)的攻擊[3,4]。此外，在CNS疾病模型的腦組織中少見補體調(diào)節(jié)分子表達，而可見大量補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細胞上，因而調(diào)控TBI后補體活化可減輕補體介導的神經(jīng)細胞損傷[3-5]。筆者曾報道經(jīng)立體定向顱內(nèi)移植的誘導型神經(jīng)干細胞（induced neural stem cells，iNSCs）可通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)，抑制反應性星形膠質(zhì)細胞增生，抑制TBI后炎癥反應，為神經(jīng)細胞存活創(chuàng)造適宜的微環(huán)境[6,7]。然而，目前國內(nèi)外少有研究報道iNSCs移植對TBI后補體活化的調(diào)節(jié)作用。為此，本研究用自由落體腦打擊裝置制備C57BL/6小鼠TBI模型，并將C57BL/6小鼠iNSCs經(jīng)靜脈注射到TBI小鼠體內(nèi)，觀察腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞的分布情況，并用流式細胞儀檢測經(jīng)TBI小鼠血清處理后iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子的水平，探討經(jīng)靜脈移植iNSCs對TBI后補體活化的作用及分子機制，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、實驗動物

健康成年雄性C57BL/6小鼠40只，8～10周齡，體質(zhì)量24～30 g，所有實驗動物（無特定病原體級）均購自北京維通利華公司。

二、主要實驗儀器和試劑

儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），超凈工作臺（ESCO公司，美國），倒置相差顯微鏡、CM1950冰凍切片機、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡和DM3000熒光顯微鏡（Leica公司，德國），C6流式細胞儀（BD Biosciences公司，美國）。

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、Accutase 酶、左旋谷酰胺和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（Invitrogen 公司，美國），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma 公司，美國），C3d 抗體（工作濃度：5 μg/mL）（R&D Systems公司，美國），C5b-9 抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Map2 抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Cd46 抗體（工作濃度：10 μg/mL） 和兔 IgG，polyclonal Isotype Control抗體（工作濃度：10 μg/mL）（Abcam 公司，美國），NeuN 抗體 （工作濃度：5 μg/mL）（Millipore 公司，美國），Alexa Fluor?555標記驢抗山羊C3d抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Alexa Fluor?555 標記山羊抗兔 C5b-9 抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Alexa Fluor?633標記山羊抗雞 Map2抗體 （工作濃度：2 μg/mL）和Alexa Fluor?633標記山羊抗小鼠NeuN抗體（工作濃度：2 μg/mL）（Life Tech 公司， 美國），4’，6-二脒基-2-苯 基 吲 哚 （4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（SouthernBiotech 公司，美國），Crry 抗體（工作濃度：5 μg/mL）、 大鼠 IgG2α，κ Isotype Control抗體（工作濃度：5 μg/mL）和APC標記山羊抗大鼠IgG抗體 （工作濃度：2 μg/mL）、PE 標記倉鼠抗小鼠Cd55抗體 （工作濃度：2 μg/mL）和 PE標記倉鼠IgG3，λ1 Isotype Control抗體 （工作濃度：2 μg/mL）（BD Biosciences公司，美國），APC標記山羊抗兔IgG 抗體（工作濃度：5 μg/mL）（Thermo 公司，美國），PE標記抗小鼠Cd59a抗體 （工作濃度：2 μg/mL）和PE標記小鼠IgG1，κ Isotype Control抗體 （工作濃度：2 μg/mL）（Biolegend 公司， 美國），PE 標記倉鼠抗小鼠 Cd55抗體（工作濃度：2 μg/mL）和 PE標記倉鼠 IgG3，λ1 Isotype Control抗體（工作濃度：2 μg/mL）（Biolegend 公司，美國）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs體外培養(yǎng)

C57BL/6小鼠 iNSCs用含 2%B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/L 左旋谷酰胺的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制備和iNSCs移植

用異氟烷氣體麻醉劑麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，備皮消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚，暴露前囟，以lambda縫向喙側(cè)2.0 mm、中線偏右側(cè)2.0 mm為撞擊點。用自由落體腦打擊裝置，撞針直徑3.0 mm，制備TBI模型。設置假手術(shù)（sham）組（10只），僅切開頭皮，不實施撞擊。于傷后1 h對TBI小鼠進行神經(jīng)功能缺損評分 （neurologicalseverityscore，NSS），將 NSS 為 4～8 分者（30 只）納入 TBI組，按照隨機數(shù)字表法選取10只用于制備TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清；余下20只按照隨機數(shù)字表法分為：iNSCs移植組（10只）和 PBS處理組（10只）。于TBI后12 h，用Accutase酶消化法制備iNSCs單細胞懸液，并用PBS漂洗3遍，用PBS重懸細胞，并分別將200 μL含5×106個iNSCs單細胞懸液或等體積PBS經(jīng)尾靜脈注射到TBI小鼠體內(nèi)。

五、腦組織冰凍切片、病理染色和雙重免疫熒光染色

細胞移植后7 d采用隨機數(shù)字表法從各組中選取6只動物進行處死，灌注固定后取出大腦，并作大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚度為10 μm。用蘇木素-伊紅染色觀察腦組織病理形態(tài)學特征。根據(jù)病理染色結(jié)果挑選腦組織切片進行雙重免疫熒光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封閉1 h后，分別加入 C3d 抗體（工作濃度：5 μg/mL）、C5b-9 抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Map2 抗體 （工作濃度：2 μg/mL）和NeuN 抗體（工作濃度：5 μg/mL）在 4℃孵育過夜。用PBS漂洗后，分別加入Alexa Fluor?555標記驢抗山羊 C3d 抗體 （工作濃度：2 μg/mL）、Alexa Fluor?555標記山羊抗兔C5b-9抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Alexa Fluor?633標記山羊抗雞Map2抗體（工作濃度：2 μg/mL） 和 Alexa Fluor?633標記山羊抗小鼠NeuN 抗體（工作濃度：2 μg/mL），室溫避光孵育 2 h。用DAPI染細胞核，封片后，在熒光顯微鏡下觀察，在20×鏡下隨機選取6個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)（特異性抗體標記）和總細胞數(shù)（DAPI標記），陽性細胞百分率（%）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

六、流式細胞儀檢測

于TBI后12 h，分別制備TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清。用Accutase酶消化法制備iNSCs單細胞懸液，用PBS漂洗后離心棄去上清，分別用250 μL的TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清重懸細胞，接種于24孔板（細胞密度為1×105個/孔），置于37℃培養(yǎng)箱中處理45 min。隨后收集細胞懸液，離心后棄去上清。用PBS漂洗3次，分別加入Crry 抗體 （工 作 濃度 ：5 μg/mL）、 大 鼠 IgG2α，κ Isotype Control抗體（工作濃度：5 μg/mL）和 APC 標記山羊抗大鼠 IgG抗體（工作濃度：2 μg/mL），避光放置在4℃冰箱。反應20～30 min后，用PBS漂洗3次，并用PBS重懸細胞。用C6流式細胞儀檢測，每個樣品收集10 000～20 000個細胞。計算平均熒光強度分析iNSCs表達Crry水平。

七、統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。小鼠腦內(nèi)C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞數(shù)量以及iNSCs中Crry平均熒光強度以均數(shù)±標準差（±s）表示，資料先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、INSCs移植物抑制 TBI小鼠腦內(nèi) C3d和C5b-9沉積于NeuN和Map2抗體陽性的神經(jīng)細胞

在TBI后7 d，sham組小鼠腦組織中少見C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞（圖1）。與之相比，TBI小鼠腦組織中明顯可見C3d和C5b-9沉積于NeuN和Map2抗體陽性的神經(jīng)細胞 （圖1）。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：與sham組相比，PBS處理組和iNSCs移植組小鼠腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及 C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與 PBS 處理組相比，iNSCs移植組小鼠腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽性、C5b-9和NeuN抗體雙陽性、C3d和Map2抗體雙陽性以及C5b-9和Map2抗體雙陽性的神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表 1）。

圖1 顱腦損傷7 d后的PBS處理組、iNSCs移植組和sham組小鼠腦組織雙重免疫熒光染色檢測（×400）

二、流式細胞儀檢測iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子水平

TBI小鼠血清組和熱滅活TBI小鼠血清組中iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子Cd46、Cd59a和Cd55水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與熱滅活TBI小鼠血清組相比，TBI小鼠血清組中iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子Crry水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表 2）。

討 論

TBI是CNS損傷性疾病，其流行病學特點呈現(xiàn)為高發(fā)病率和高致死、致殘率，嚴重危害人類生命健康[8]。有研究表明，TBI后繼發(fā)性腦損傷是由多種因素參與的復雜病理過程，直接影響患者預后，如何有效防治TBI后繼發(fā)性腦損傷是醫(yī)學研究的熱點和難點[8,9]。補體系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可參與機體的免疫調(diào)節(jié)和病理損傷反應，因此調(diào)控TBI后補體活化可減輕補體介導的神經(jīng)細胞損傷，為防治TBI后繼發(fā)性腦損傷提供幫助[10,11]。目前，調(diào)控補體活化的方法主要是補體抑制劑和基因靶向藥物的應用，然而其抑制TBI后補體活化的療效并不理想[12,13]。為此，本課題組探討了iNSCs移植對TBI后補體活化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與既往文獻報道相符，在正常動物CNS內(nèi)，即在sham組小鼠腦組織中，補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9表達量較低[14,15]。而當CNS損傷后，即在TBI小鼠腦組織中，可觀察到大量補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細胞上。補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9來源廣泛，可從外周血液循環(huán)中經(jīng)功能紊亂的血腦屏障滲漏，也可由浸潤的免疫細胞或CNS內(nèi)固有細胞合成[5]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，各組內(nèi)NeuN陽性和Map2陽性的神經(jīng)細胞上沉積的補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9具有一致性，說明TBI后神經(jīng)細胞的胞體與軸突均遭受補體系統(tǒng)的攻擊。值得注意的是，接受經(jīng)靜脈移植iNSCs的TBI小鼠腦組織中，NeuN陽性和Map2陽性的神經(jīng)細胞上沉積的補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9均明顯少于接受PBS處理的TBI小鼠。由此可見，iNSCs移植物可抑制TBI后補體活化，減輕補體活化對神經(jīng)細胞的損傷。

為探討經(jīng)靜脈移植iNSCs抑制TBI后補體活化的分子機制，本研究制備了TBI小鼠血清和缺乏補體活性成分的熱滅活TBI小鼠血清分別在體外處理iNSCs，而后用流式細胞儀檢測iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子的水平。與既往文獻報道“干細胞可表達補體受體 CR2、C3aR和 C5aR以及補體調(diào)節(jié)分子 Crry、Cd46、Cd55和Cd59”一致，本研究發(fā)現(xiàn) TBI小鼠血清處理后，iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子Crry的水平明顯上調(diào)[16,17]。Crry是嚙齒類動物調(diào)節(jié)補體活化的重要成分，類似于人類補體調(diào)節(jié)分子Cd46和Cd55[18,19]?？梢奀rry具有抑制C3轉(zhuǎn)化酶的作用，從而調(diào)控補體系統(tǒng)激活，并減少下游補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9的形成[20-22]。本研究結(jié)果提示：經(jīng)靜脈移植iNSCs可能通過增加Crry的表達量，發(fā)揮抑制補體活化的作用。此外，經(jīng)TBI小鼠血清處理的iNSCs選擇性上調(diào)Crry的表達量也是本研究的新發(fā)現(xiàn)。

表1 顱腦損傷7 d后的各組小鼠腦內(nèi)特異性抗體標記細胞的百分率（±s，%）

表1 顱腦損傷7 d后的各組小鼠腦內(nèi)特異性抗體標記細胞的百分率（±s，%）

與 sham 組比較，aP＜0.05；與 iNSCs移植組比較，bP＜0.05

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表2 流式細胞儀檢測iNSCs表達補體調(diào)節(jié)分子的水平

綜上所述，經(jīng)靜脈移植iNSCs可抑制TBI后補體活化，減少補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細胞的胞體和軸突，從而減輕補體活化介導的神經(jīng)損傷。通過體外實驗，筆者注意到iNSCs可接受TBI小鼠血清刺激，選擇性上調(diào)補體調(diào)節(jié)分子Crry的表達量，而理論上補體調(diào)節(jié)分子Crry可發(fā)揮抑制補體活化，減少補體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9形成的作用，為進一步探討經(jīng)靜脈移植iNSCs抑制TBI后補體活化的作用機制提供了新的方向。因此，在后續(xù)研究中，筆者仍將重點關注iNSCs選擇性上調(diào)補體調(diào)節(jié)分子Crry表達量的分子機制，以及Crry表達量與TBI后補體活化水平間的量效關系，進而揭示iNSCs移植物抑制TBI后補體活化的分子機制。