高謀 徐如祥 王文佳 董勤 丁柏勻 姚慧 楊志軍

補(bǔ)體系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，補(bǔ)體系統(tǒng)激活可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)介導(dǎo)顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）后炎癥反應(yīng)，也可形成補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物（C5b-9）加重神經(jīng)細(xì)胞損傷[1,2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子 Crry、Cd46、Cd59a和 Cd55，減輕補(bǔ)體活化介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[3,4]。然而，由于神經(jīng)細(xì)胞選擇性低表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子，因此其易遭受補(bǔ)體系統(tǒng)的攻擊[3,4]。此外，在CNS疾病模型的腦組織中少見(jiàn)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子表達(dá)，而可見(jiàn)大量補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細(xì)胞上，因而調(diào)控TBI后補(bǔ)體活化可減輕補(bǔ)體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[3-5]。筆者曾報(bào)道經(jīng)立體定向顱內(nèi)移植的誘導(dǎo)型神經(jīng)干細(xì)胞（induced neural stem cells，iNSCs）可通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)，抑制反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，抑制TBI后炎癥反應(yīng)，為神經(jīng)細(xì)胞存活創(chuàng)造適宜的微環(huán)境[6,7]。然而，目前國(guó)內(nèi)外少有研究報(bào)道iNSCs移植對(duì)TBI后補(bǔ)體活化的調(diào)節(jié)作用。為此，本研究用自由落體腦打擊裝置制備C57BL/6小鼠TBI模型，并將C57BL/6小鼠iNSCs經(jīng)靜脈注射到TBI小鼠體內(nèi)，觀察腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C5b-9和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C3d和Map2抗體雙陽(yáng)性以及C5b-9和Map2抗體雙陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞的分布情況，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)TBI小鼠血清處理后iNSCs表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子的水平，探討經(jīng)靜脈移植iNSCs對(duì)TBI后補(bǔ)體活化的作用及分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性C57BL/6小鼠40只，8～10周齡，體質(zhì)量24～30 g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（無(wú)特定病原體級(jí)）均購(gòu)自北京維通利華公司。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國(guó)），超凈工作臺(tái)（ESCO公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡、CM1950冰凍切片機(jī)、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡和DM3000熒光顯微鏡（Leica公司，德國(guó)），C6流式細(xì)胞儀（BD Biosciences公司，美國(guó)）。

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、Accutase 酶、左旋谷酰胺和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（Invitrogen 公司，美國(guó)），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma 公司，美國(guó)），C3d 抗體（工作濃度：5 μg/mL）（R&D Systems公司，美國(guó)），C5b-9 抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Map2 抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Cd46 抗體（工作濃度：10 μg/mL） 和兔 IgG，polyclonal Isotype Control抗體（工作濃度：10 μg/mL）（Abcam 公司，美國(guó)），NeuN 抗體 （工作濃度：5 μg/mL）（Millipore 公司，美國(guó)），Alexa Fluor?555標(biāo)記驢抗山羊C3d抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Alexa Fluor?555 標(biāo)記山羊抗兔 C5b-9 抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Alexa Fluor?633標(biāo)記山羊抗雞 Map2抗體 （工作濃度：2 μg/mL）和Alexa Fluor?633標(biāo)記山羊抗小鼠NeuN抗體（工作濃度：2 μg/mL）（Life Tech 公司， 美國(guó)），4’，6-二脒基-2-苯 基 吲 哚 （4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（SouthernBiotech 公司，美國(guó)），Crry 抗體（工作濃度：5 μg/mL）、 大鼠 IgG2α，κ Isotype Control抗體（工作濃度：5 μg/mL）和APC標(biāo)記山羊抗大鼠IgG抗體 （工作濃度：2 μg/mL）、PE 標(biāo)記倉(cāng)鼠抗小鼠Cd55抗體 （工作濃度：2 μg/mL）和 PE標(biāo)記倉(cāng)鼠IgG3，λ1 Isotype Control抗體 （工作濃度：2 μg/mL）（BD Biosciences公司，美國(guó)），APC標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（工作濃度：5 μg/mL）（Thermo 公司，美國(guó)），PE標(biāo)記抗小鼠Cd59a抗體 （工作濃度：2 μg/mL）和PE標(biāo)記小鼠IgG1，κ Isotype Control抗體 （工作濃度：2 μg/mL）（Biolegend 公司， 美國(guó)），PE 標(biāo)記倉(cāng)鼠抗小鼠 Cd55抗體（工作濃度：2 μg/mL）和 PE標(biāo)記倉(cāng)鼠 IgG3，λ1 Isotype Control抗體（工作濃度：2 μg/mL）（Biolegend 公司，美國(guó)）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs體外培養(yǎng)

C57BL/6小鼠 iNSCs用含 2%B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/L 左旋谷酰胺的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制備和iNSCs移植

用異氟烷氣體麻醉劑麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，備皮消毒，鋪無(wú)菌洞巾，切開(kāi)皮膚，暴露前囟，以lambda縫向喙側(cè)2.0 mm、中線偏右側(cè)2.0 mm為撞擊點(diǎn)。用自由落體腦打擊裝置，撞針直徑3.0 mm，制備TBI模型。設(shè)置假手術(shù)（sham）組（10只），僅切開(kāi)頭皮，不實(shí)施撞擊。于傷后1 h對(duì)TBI小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分 （neurologicalseverityscore，NSS），將 NSS 為 4～8 分者（30 只）納入 TBI組，按照隨機(jī)數(shù)字表法選取10只用于制備TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清；余下20只按照隨機(jī)數(shù)字表法分為：iNSCs移植組（10只）和 PBS處理組（10只）。于TBI后12 h，用Accutase酶消化法制備iNSCs單細(xì)胞懸液，并用PBS漂洗3遍，用PBS重懸細(xì)胞，并分別將200 μL含5×106個(gè)iNSCs單細(xì)胞懸液或等體積PBS經(jīng)尾靜脈注射到TBI小鼠體內(nèi)。

五、腦組織冰凍切片、病理染色和雙重免疫熒光染色

細(xì)胞移植后7 d采用隨機(jī)數(shù)字表法從各組中選取6只動(dòng)物進(jìn)行處死，灌注固定后取出大腦，并作大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚度為10 μm。用蘇木素-伊紅染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)病理染色結(jié)果挑選腦組織切片進(jìn)行雙重免疫熒光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封閉1 h后，分別加入 C3d 抗體（工作濃度：5 μg/mL）、C5b-9 抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Map2 抗體 （工作濃度：2 μg/mL）和NeuN 抗體（工作濃度：5 μg/mL）在 4℃孵育過(guò)夜。用PBS漂洗后，分別加入Alexa Fluor?555標(biāo)記驢抗山羊 C3d 抗體 （工作濃度：2 μg/mL）、Alexa Fluor?555標(biāo)記山羊抗兔C5b-9抗體（工作濃度：2 μg/mL）、Alexa Fluor?633標(biāo)記山羊抗雞Map2抗體（工作濃度：2 μg/mL） 和 Alexa Fluor?633標(biāo)記山羊抗小鼠NeuN 抗體（工作濃度：2 μg/mL），室溫避光孵育 2 h。用DAPI染細(xì)胞核，封片后，在熒光顯微鏡下觀察，在20×鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（特異性抗體標(biāo)記）和總細(xì)胞數(shù)（DAPI標(biāo)記），陽(yáng)性細(xì)胞百分率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

六、流式細(xì)胞儀檢測(cè)

于TBI后12 h，分別制備TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清。用Accutase酶消化法制備iNSCs單細(xì)胞懸液，用PBS漂洗后離心棄去上清，分別用250 μL的TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清重懸細(xì)胞，接種于24孔板（細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔），置于37℃培養(yǎng)箱中處理45 min。隨后收集細(xì)胞懸液，離心后棄去上清。用PBS漂洗3次，分別加入Crry 抗體 （工 作 濃度 ：5 μg/mL）、 大 鼠 IgG2α，κ Isotype Control抗體（工作濃度：5 μg/mL）和 APC 標(biāo)記山羊抗大鼠 IgG抗體（工作濃度：2 μg/mL），避光放置在4℃冰箱。反應(yīng)20～30 min后，用PBS漂洗3次，并用PBS重懸細(xì)胞。用C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣品收集10 000～20 000個(gè)細(xì)胞。計(jì)算平均熒光強(qiáng)度分析iNSCs表達(dá)Crry水平。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。小鼠腦內(nèi)C3d和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C5b-9和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C3d和Map2抗體雙陽(yáng)性以及C5b-9和Map2抗體雙陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量以及iNSCs中Crry平均熒光強(qiáng)度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、INSCs移植物抑制 TBI小鼠腦內(nèi) C3d和C5b-9沉積于NeuN和Map2抗體陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞

在TBI后7 d，sham組小鼠腦組織中少見(jiàn)C3d和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C5b-9和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C3d和Map2抗體雙陽(yáng)性以及C5b-9和Map2抗體雙陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞（圖1）。與之相比，TBI小鼠腦組織中明顯可見(jiàn)C3d和C5b-9沉積于NeuN和Map2抗體陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞 （圖1）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：與sham組相比，PBS處理組和iNSCs移植組小鼠腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C5b-9和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C3d和Map2抗體雙陽(yáng)性以及 C5b-9和Map2抗體雙陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與 PBS 處理組相比，iNSCs移植組小鼠腦組織中C3d和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C5b-9和NeuN抗體雙陽(yáng)性、C3d和Map2抗體雙陽(yáng)性以及C5b-9和Map2抗體雙陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

圖1 顱腦損傷7 d后的PBS處理組、iNSCs移植組和sham組小鼠腦組織雙重免疫熒光染色檢測(cè)（×400）

二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)iNSCs表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子水平

TBI小鼠血清組和熱滅活TBI小鼠血清組中iNSCs表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子Cd46、Cd59a和Cd55水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與熱滅活TBI小鼠血清組相比，TBI小鼠血清組中iNSCs表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子Crry水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 2）。

討 論

TBI是CNS損傷性疾病，其流行病學(xué)特點(diǎn)呈現(xiàn)為高發(fā)病率和高致死、致殘率，嚴(yán)重危害人類生命健康[8]。有研究表明，TBI后繼發(fā)性腦損傷是由多種因素參與的復(fù)雜病理過(guò)程，直接影響患者預(yù)后，如何有效防治TBI后繼發(fā)性腦損傷是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[8,9]。補(bǔ)體系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和病理?yè)p傷反應(yīng)，因此調(diào)控TBI后補(bǔ)體活化可減輕補(bǔ)體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，為防治TBI后繼發(fā)性腦損傷提供幫助[10,11]。目前，調(diào)控補(bǔ)體活化的方法主要是補(bǔ)體抑制劑和基因靶向藥物的應(yīng)用，然而其抑制TBI后補(bǔ)體活化的療效并不理想[12,13]。為此，本課題組探討了iNSCs移植對(duì)TBI后補(bǔ)體活化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符，在正常動(dòng)物CNS內(nèi)，即在sham組小鼠腦組織中，補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9表達(dá)量較低[14,15]。而當(dāng)CNS損傷后，即在TBI小鼠腦組織中，可觀察到大量補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細(xì)胞上。補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9來(lái)源廣泛，可從外周血液循環(huán)中經(jīng)功能紊亂的血腦屏障滲漏，也可由浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞或CNS內(nèi)固有細(xì)胞合成[5]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，各組內(nèi)NeuN陽(yáng)性和Map2陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞上沉積的補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9具有一致性，說(shuō)明TBI后神經(jīng)細(xì)胞的胞體與軸突均遭受補(bǔ)體系統(tǒng)的攻擊。值得注意的是，接受經(jīng)靜脈移植iNSCs的TBI小鼠腦組織中，NeuN陽(yáng)性和Map2陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞上沉積的補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9均明顯少于接受PBS處理的TBI小鼠。由此可見(jiàn)，iNSCs移植物可抑制TBI后補(bǔ)體活化，減輕補(bǔ)體活化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

為探討經(jīng)靜脈移植iNSCs抑制TBI后補(bǔ)體活化的分子機(jī)制，本研究制備了TBI小鼠血清和缺乏補(bǔ)體活性成分的熱滅活TBI小鼠血清分別在體外處理iNSCs，而后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)iNSCs表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子的水平。與既往文獻(xiàn)報(bào)道“干細(xì)胞可表達(dá)補(bǔ)體受體 CR2、C3aR和 C5aR以及補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子 Crry、Cd46、Cd55和Cd59”一致，本研究發(fā)現(xiàn) TBI小鼠血清處理后，iNSCs表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子Crry的水平明顯上調(diào)[16,17]。Crry是嚙齒類動(dòng)物調(diào)節(jié)補(bǔ)體活化的重要成分，類似于人類補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子Cd46和Cd55[18,19]。可見(jiàn)Crry具有抑制C3轉(zhuǎn)化酶的作用，從而調(diào)控補(bǔ)體系統(tǒng)激活，并減少下游補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9的形成[20-22]。本研究結(jié)果提示：經(jīng)靜脈移植iNSCs可能通過(guò)增加Crry的表達(dá)量，發(fā)揮抑制補(bǔ)體活化的作用。此外，經(jīng)TBI小鼠血清處理的iNSCs選擇性上調(diào)Crry的表達(dá)量也是本研究的新發(fā)現(xiàn)。

表1 顱腦損傷7 d后的各組小鼠腦內(nèi)特異性抗體標(biāo)記細(xì)胞的百分率（±s，%）

表1 顱腦損傷7 d后的各組小鼠腦內(nèi)特異性抗體標(biāo)記細(xì)胞的百分率（±s，%）

與 sham 組比較，aP＜0.05；與 iNSCs移植組比較，bP＜0.05

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表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)iNSCs表達(dá)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子的水平

綜上所述，經(jīng)靜脈移植iNSCs可抑制TBI后補(bǔ)體活化，減少補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9沉積于神經(jīng)細(xì)胞的胞體和軸突，從而減輕補(bǔ)體活化介導(dǎo)的神經(jīng)損傷。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，筆者注意到iNSCs可接受TBI小鼠血清刺激，選擇性上調(diào)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子Crry的表達(dá)量，而理論上補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子Crry可發(fā)揮抑制補(bǔ)體活化，減少補(bǔ)體活化產(chǎn)物C3d和C5b-9形成的作用，為進(jìn)一步探討經(jīng)靜脈移植iNSCs抑制TBI后補(bǔ)體活化的作用機(jī)制提供了新的方向。因此，在后續(xù)研究中，筆者仍將重點(diǎn)關(guān)注iNSCs選擇性上調(diào)補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子Crry表達(dá)量的分子機(jī)制，以及Crry表達(dá)量與TBI后補(bǔ)體活化水平間的量效關(guān)系，進(jìn)而揭示iNSCs移植物抑制TBI后補(bǔ)體活化的分子機(jī)制。