湯 雄，張 炯綜述，王金泉審校

作者單位：210002南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院）國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心全軍腎臟病研究所[湯 雄（醫(yī)學(xué)碩士研究生）、張 炯、王金泉]

0 引 言

腎病通常按起病方式和臨床轉(zhuǎn)歸可分為慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）和急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。AKI和CKD既互相有區(qū)別，又互相聯(lián)系，一方面CKD是AKI發(fā)生的高危因素，另一方面AKI也可進(jìn)展至 CKD［1］。2004年美國(guó)公共衛(wèi)生調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，成年人中CKD的發(fā)病率約為14%［2］，對(duì)中國(guó)人群的大型流行病調(diào)查表明中國(guó)成人CKD發(fā)病率為10.8%［3］，隨著人口老齡化及社會(huì)環(huán)境的變遷中國(guó)成人CKD發(fā)病率有可能進(jìn)一步上升。而AKI作為患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的高危因素，一項(xiàng)針對(duì)四大洲AKI事件的Meta分析指出，心臟手術(shù)、重癥監(jiān)護(hù)、創(chuàng)傷及社區(qū)獲得的成人AKI綜合死亡率23.9%，兒童為13.8%［4］。然而目前的臨床用藥難以涵蓋不同病因、不同病理改變的CKD及AKI，難以逆轉(zhuǎn)CKD的進(jìn)展及在此基礎(chǔ)上AKI的發(fā)生。最近，對(duì)一些腎疾病動(dòng)物模型的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞死亡在疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，學(xué)界提出針對(duì)細(xì)胞死亡與生存調(diào)控異常的潛在靶點(diǎn)。本文主要對(duì)近年來在細(xì)胞死亡與生存異常調(diào)控方面的研究進(jìn)展以及干預(yù)細(xì)胞死亡與生存異常調(diào)控在CKD和AKI病理生理過程中可能發(fā)揮的療效作一綜述。

1 腎病中的細(xì)胞死亡通路

1.1 外源性和內(nèi)源性凋亡通路 細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到嚴(yán)密調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程，其中半胱天冬酶依賴的細(xì)胞凋亡可由內(nèi)源性或外源性因素刺激啟動(dòng)［5］。內(nèi)源性因素包括細(xì)胞應(yīng)激、發(fā)育信號(hào)以及生長(zhǎng)因子下調(diào)等，這些刺激可導(dǎo)致包括線粒體損傷在內(nèi)的細(xì)胞完整性受到破壞。Bcl-2家族蛋白在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡線粒體通路調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，其中促凋亡因子（如Bim或Bid）和效應(yīng)因子（如Bak和Bax）能抵消抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1的抑制作用。當(dāng)平衡被打破傾向于凋亡時(shí)，Bcl-2會(huì)釋放細(xì)胞色素C，形成凋亡復(fù)合體1（Apaf-1），并活化半胱天冬酶-9（caspase-9）?；罨腸aspase-9隨后激活caspase-3和 caspase-7，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［6］。目前多借助于Bax-或Bak-缺陷小鼠來觀察線粒體凋亡通路在腎臟損傷中的作用。在缺血性急性腎損傷的小鼠模型中，敲除Bax或Bak基因能抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，對(duì)腎起部分保護(hù)作用［7］。

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族的死亡配體與細(xì)胞表面含死亡結(jié)構(gòu)域的TNF受體（TNFR）結(jié)合啟動(dòng)外源性細(xì)胞凋亡通路，并募集各類因子形成受體相關(guān)的死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物。死亡受體4和5（death receptor，DR4、DR5）以及Fas共同募集配體蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD），與受體相互作用蛋白1（receptor interaction protein，RIP1）結(jié)合，進(jìn)而引起caspase-8激活及其下游效應(yīng)因子caspase-3和caspase-7活化［8］。TNFR1和DR3在其受體復(fù)合物中結(jié)合其他蛋白質(zhì)分子，包括TNFR相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域、RIP1、TNFR相關(guān)因子2和細(xì)胞凋亡抑制劑（c-IAP1、c-IAP2）。c-IAP1和c-IAP2通過各種連鎖反應(yīng)使受體相互作用蛋白1泛素化，TNFR1受體相關(guān)復(fù)合體中K63-和K11-連接的多聚泛素鏈?zhǔn)瞧渲凶钪匾囊粭l［9］。研究證實(shí)通過去泛素化酶A20去除RIP1中的c-IAP蛋白或泛素化基團(tuán)可形成完整的具有功能的復(fù)合體Ⅱ，繼而活化caspase-8并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。抑制性caspase-8樣分子FLICE-抑制蛋白也可阻斷這條通路，通過與caspase-8競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FADD，并募集凋亡受體復(fù)合物來抑制凋亡受體-凋亡途徑的活化［11］。外源性和內(nèi)源性凋亡通路最終都是由活化效應(yīng)因子caspase-3和caspase-7，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。

盡管TNF配體和TNFR受體超家族極大地影響腎損傷時(shí)的細(xì)胞存活和炎癥反應(yīng)，但單個(gè)配體或受體的功能并不完全清楚，且與其他凋亡配體和受體相比，F(xiàn)as在缺血性急性腎損傷細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮更大的作用［13］。目前腎病理學(xué)研究中的最引人關(guān)注的TNF家族成員為TNF相關(guān)配體TNF樣弱凋亡誘導(dǎo)因子（TNF-like weak inducer of ap-optosis，TWEAK）。TWEAK通過經(jīng)典或非經(jīng)典核因子-κB以及絲裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)［14］?？筎WEAK抗體作為一種組織細(xì)胞保護(hù)策略在狼瘡性腎炎中的療效正處于臨床試驗(yàn)階段［15］。

1.2 調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死 半胱天冬酶活性受到抑制能夠中止TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，在這種情況下，細(xì)胞可進(jìn)入另一條死亡途徑——壞死性凋亡。壞死性凋亡是由TNF信號(hào)啟動(dòng)的可調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死，受RIP1和RIP3激酶調(diào)節(jié)［16］。除TNF，病原體識(shí)別受體、Toll樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體以及RNA解旋酶也可誘導(dǎo)壞死性凋亡。一旦調(diào)亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體形成，RIP1和RIP3就會(huì)發(fā)生一系列自磷酸化和交叉磷酸化反應(yīng)，磷酸化的RIP3可結(jié)合并磷酸化混合系蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed lineage kinase domain-like，MLKL），這是誘導(dǎo)壞死性細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵步驟，MLKL的磷酸化能觸發(fā)自身寡聚化并向質(zhì)膜易位從而促進(jìn)壞死性細(xì)胞凋亡［17］。RIP1激酶抑制劑（necrostatin-1）或RIP3激酶抑制劑可導(dǎo)致激酶失活，從而阻斷壞死性凋亡［18］。

借助于necrostatin-1和RIP3的基因敲除已經(jīng)證實(shí)壞死性凋亡部分參與了腎損傷過程。necrostatin-1能有效減輕小鼠急性腎損傷以及降低血尿素氮和肌酐水平，RIP3缺陷小鼠同樣也能有效減輕腎缺血-再灌注急性腎損傷［17］。對(duì)小鼠腎移植模型研究表明，與對(duì)照組相比，接受來自RIP3基因敲除（供體）的移植腎小鼠存活期更長(zhǎng)，移植腎功能更好，從而表明供腎中RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡以及其他死亡信號(hào)通路活化能夠促進(jìn)炎性腎損傷［19］。因而，有理由相信針對(duì)RIP1和（或）RIP3的靶向治療，是減輕缺血-再灌注腎損傷和提高移植腎存活率的一種潛在治療策略。

1.3 其他類型死亡通路 與壞死性凋亡不同，細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，當(dāng)組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí)，caspase-1和caspase-11（小鼠）或caspase-4和caspase-5（人），可引起細(xì)胞迅速腫脹和溶解，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎性復(fù)合體的釋放，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥反應(yīng)擴(kuò)散［20］。最近的遺傳學(xué)研究表明，caspase-11作為細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵，能夠引發(fā)細(xì)胞的死亡，而caspase-1則介導(dǎo)IL-1β和IL-18的分泌，促進(jìn)炎癥擴(kuò)散。Caspase-1和caspase-11能夠裂解gasdermin D（gsdmD），使后者N端和C端的結(jié)構(gòu)域分開，N端片段可識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞膜的磷脂類分子，在細(xì)胞膜上形成孔隙，導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓的變化，出現(xiàn)細(xì)胞裂解、焦亡［21］。Zhan等［22］對(duì)小鼠腎缺血-再灌注損傷的研究顯示，損傷后腎組織中caspase-1，caspase-11和IL-1β的表達(dá)增加，提示腎缺血-再灌注損傷中可能存在細(xì)胞焦亡。對(duì)選擇性caspase-11抑制劑和caspase-1/11雙敲除小鼠的進(jìn)一步研究，將有助于更全面的認(rèn)識(shí)細(xì)胞焦亡對(duì)腎缺血-再灌注損傷的作用。

線粒體與固有的細(xì)胞凋亡通路相關(guān)［11］；此外，由離子、核苷酸、活性氧自由基和其他因素激活的線粒體膜通透性改變（mitochondrial permeability transition，MPT）也可導(dǎo)致壞死性細(xì)胞死亡。線粒體跨膜通道的開放稱為MPT，受親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，CYPD）的調(diào)節(jié)，CYPD為可被免疫抑制劑環(huán)孢菌素A或薩菲菌素A抑制的蛋白質(zhì)［23］。對(duì)CypD基因敲除小鼠腎損傷的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CypD基因敲除可減少壞死性凋亡，進(jìn)而減輕小鼠IRI腎損傷，提示小鼠IRI腎損傷可能存在MPT［24］。更有意義的是，在IRI模型中，CypD和RIP3基因的雙敲除可較任一單一基因敲除有更大的獲益。RIP1抑制劑-1和MPT抑制劑薩菲菌素A的聯(lián)合應(yīng)用也證實(shí)了上述研究結(jié)論，表明腎缺血-再灌注損傷中可能同時(shí)存在的兩種獨(dú)立的調(diào)節(jié)性壞死途徑［25］。

依賴于鐵和谷胱甘肽代謝的調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死，稱之為鐵凋亡（ferroptosis），是另一種細(xì)胞死亡方式。鐵凋亡引起ROS的積聚，并能夠被ferrostatin-1抑制。Ferrostatin-1能有效阻斷IRI引起的腎小管損傷，并降低血清尿素氮和肌酐水平。此外，ferrostatin-1能阻止腎近端腎小管上皮細(xì)胞死亡，同時(shí)減少氧化損傷后ROS的產(chǎn)生［26］。基于ferrostatin-1上述腎保護(hù)作用，鐵凋亡可能是缺血-再灌注腎損傷機(jī)制之一，可作為缺血-再灌注腎損傷的潛在治療靶點(diǎn)。

由紫外線、ROS或烷基化劑誘導(dǎo)的DNA損傷能激活多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP1），有助于損傷的修復(fù)。但PARP1過度活化可引起parthanatos——PARP1依賴的細(xì)胞死亡［27］。對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，PARP1敲除小鼠腎間質(zhì)纖維化明顯減輕，炎性因子前體表達(dá)明顯減弱，表明PARP1在梗阻性腎損傷中介導(dǎo)了壞死性細(xì)胞死亡，主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化與促進(jìn)炎性信號(hào)傳導(dǎo)［28］。同樣，PARP1缺乏能減少順鉑誘導(dǎo)的腎功能損傷，氧化應(yīng)激、促炎性因子誘導(dǎo)的腎小管壞死［29］。上述研究表明PARP1可能是梗阻性腎損傷和其他腎毒性腎損傷的潛在治療靶點(diǎn)。

其他形式的細(xì)胞死亡，如失巢凋亡和自噬性細(xì)胞死亡，與腎病的聯(lián)系并不明確。越來越多的證據(jù)顯示，大多數(shù)腎病理損害不能歸因于與某一種單一的細(xì)胞死亡通路。大多數(shù)情況下，腎損傷時(shí)會(huì)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞死亡通路激活，致使對(duì)疾病過程和致病機(jī)制的理解難度增加，同時(shí)也不利于發(fā)現(xiàn)最有效的治療方法。最典型的是足細(xì)胞，作為一種高度分化的上皮細(xì)胞，在足細(xì)胞中幾乎能觀察到所有的細(xì)胞死亡通路［30］。盡管存在諸多困難，良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，借助于基因敲除和特異性化學(xué)抑制劑，可以最大程度地理解各種細(xì)胞死亡途徑在特定腎病理過程的意義。

2 干預(yù)AKI細(xì)胞死亡通路

按病變部位AKI可分為腎前性，腎性及腎后性，按病理改變也可分為急性間質(zhì)性腎炎及急性腎小管壞死，病因又能夠分為腎毒性藥物性、腎缺血等，鑒于AKI發(fā)生的病因、病理多樣性，AKI最為有效的治療應(yīng)該是對(duì)高?；颊叩念A(yù)防。盡管目前尚無針對(duì)性的臨床藥物，缺乏臨床試驗(yàn)，一些研究也顯示靶向干預(yù)細(xì)胞死亡通路活化藥物療效有限，并不能減輕、消除類似缺血-再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和/或腎損害［31-33］。但干預(yù)細(xì)胞死亡預(yù)防和治療AKI存在扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，如移植腎功能延遲恢復(fù)最常見原因是缺血-再灌注損傷，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路的激活從而對(duì)移植腎帶來不良后果。對(duì)AKI過程中細(xì)胞死亡通路更深入的認(rèn)識(shí)及更加精準(zhǔn)的靶藥物治療，將為AKI的治療提供新的思路及治療策略。

3 干預(yù)腎病相關(guān)細(xì)胞死亡通路

根據(jù)腎病理生理學(xué)特性，針對(duì)細(xì)胞死亡通路的治療著重于阻止細(xì)胞死亡的發(fā)生，同時(shí)抑制細(xì)胞死亡相關(guān)因子的釋放，從而阻斷這些因子促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展。既往研究顯示在RIP1和RIP3激酶介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性壞死過程中，RIP3起主導(dǎo)作用。但最近的研究表明，RIP3激酶基因敲除或化學(xué)抑制可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致突變動(dòng)物死亡［17］。MLKL作為另一種壞死性調(diào)節(jié)因子，與RIP1和RIP3不同，MLKL不具有可識(shí)別酶活性，因此很難成為藥物干預(yù)靶點(diǎn)［18］。不排除未來會(huì)發(fā)現(xiàn)一些小分子化合物，可選擇性阻斷壞死性凋亡細(xì)胞信號(hào)誘導(dǎo)的MLKL構(gòu)象變化，并將MLKL易位到胞膜中，從而阻止壞死性細(xì)胞死亡。

RIP1作為上述通路中的第三種壞死性調(diào)節(jié)因子，是一種通路頂端激酶，可調(diào)控大多數(shù)的壞死性凋亡的應(yīng)答。與RIP3不同，RIP1激酶功能突變并不會(huì)對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物有任何不利的影響。迄今發(fā)現(xiàn)的小分子RIP1激酶抑制劑具有極高的選擇性，在動(dòng)物模型中證實(shí)安全性好［32］。RIP1激酶抑制劑同樣具有較高安全性，RIP1激酶在壞死性凋亡炎癥通路中具有重要的功能，這些特征使RIP1為一個(gè)幾乎完美的治療靶點(diǎn)。已有藥企將RIP1作為小分子激酶抑制劑的靶目標(biāo)，進(jìn)一步將開展臨床研究以證實(shí)以RIP1激酶活性為干預(yù)目標(biāo)在腎臟病理學(xué)改變上是否有效果。

除細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡，細(xì)胞焦亡、parthanatos、MPT介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和鐵凋亡等也在腎病發(fā)生發(fā)展中起作用。雖然細(xì)胞焦亡的確切作用有待臨床驗(yàn)證，但在動(dòng)物模型中已經(jīng)獲得了令人振奮的研究結(jié)果，將CYPD、PARP1或鐵凋亡等通路作為目標(biāo)可能成為干預(yù)腎病的新策略。目前優(yōu)化鐵凋亡抑制劑ferrostatin-1，以驗(yàn)證其逆轉(zhuǎn)缺血-再灌注腎損傷中的氧化應(yīng)激相關(guān)損害的研究正在進(jìn)行中。以CYPD和MPT介導(dǎo)的細(xì)胞死亡為靶點(diǎn)的藥物已經(jīng)用于治療炎癥性疾病及預(yù)防器官移植排斥反應(yīng)。有理由相信未來也可以通過環(huán)孢素A或薩菲菌素A來治療多種腎病，包括腎病綜合征和急性腎損傷。

4 結(jié) 語

綜上所述，干預(yù)細(xì)胞死亡通路作為腎病治療的新策略，進(jìn)一步建立可靠的動(dòng)物模型、臨床前研究及良好設(shè)計(jì)的臨床實(shí)驗(yàn)將會(huì)顯示以干預(yù)細(xì)胞死亡通路為目標(biāo)的確切療效。如同大多數(shù)癌癥患者接受多種抗癌藥物的聯(lián)合治療一樣，腎病患者也能從多種細(xì)胞死亡抑制劑聯(lián)合使用中獲益。同時(shí)，尋找發(fā)現(xiàn)確切的具有診斷性及預(yù)后判斷性生物標(biāo)記物至關(guān)重要。在急慢性腎損傷致病機(jī)制、動(dòng)物模型和臨床研究中仍需付出更多的努力，以發(fā)現(xiàn)能夠直達(dá)病灶、直擊致病機(jī)制靶點(diǎn)的真正有效的藥物，給予腎病患者帶來新的曙光。