周陽(yáng)子， 邊名鴻， 劉文藝， 蔣佳靜， 許文靜

(四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院， 四川 自貢 643000)

引 言

醬香型白酒是中國(guó)白酒四大基本香型之一，在醬香型白酒生產(chǎn)中醬香物質(zhì)主要來(lái)源于高溫大曲，其形成與微生物的代謝活動(dòng)及美拉德反應(yīng)有密切聯(lián)系[1]。高溫大曲發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，中后期品溫高達(dá)60 ℃以上，獨(dú)特的制曲工藝形成了特殊的微生物區(qū)系[2]。在高溫大曲中主要以細(xì)菌居多，霉菌次之，酵母菌最少，有研究說(shuō)高溫大曲是一種“細(xì)菌曲”[3-4]。細(xì)菌作為醬香型白酒釀造過(guò)程中最重要的一類微生物，對(duì)增強(qiáng)醬香型白酒風(fēng)味、提高質(zhì)量起著重要作用，一直以來(lái)都是研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。信春暉等[5]曾報(bào)道過(guò)嗜熱芽孢桿菌是產(chǎn)生醬香風(fēng)味和芝麻香風(fēng)味的主要菌種。姜鵬[6]等將三株產(chǎn)香突出細(xì)菌優(yōu)化后添加至大曲中，大曲的質(zhì)量有所改善，白酒出酒率、原酒總酸和總酯均有所提高。TANG[7]等使用高通量測(cè)序研究茅臺(tái)和國(guó)臺(tái)大曲細(xì)菌的多樣性，其細(xì)菌豐富度不同但細(xì)菌菌落組成是基本一致。對(duì)高溫大曲中細(xì)菌的研究，有利于揭示醬香的形成機(jī)制。

本文從高溫大曲中篩選出產(chǎn)香細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行了耐受性試驗(yàn)，并通過(guò)固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)研究了該菌的揮發(fā)性風(fēng)味產(chǎn)物及對(duì)醬香的貢獻(xiàn)，為產(chǎn)醬香微生物的挖掘及應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

高溫大曲樣品，取自赤水河畔的名優(yōu)酒廠。大米、小麥、麩皮：均為市售。

1.1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(g/100 mL)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，瓊脂2.0。

細(xì)菌液體培養(yǎng)基(g/100 mL)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0.5。

高粱小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基：小麥與高粱質(zhì)量比為1:1，小麥全部粉碎，高粱部分粉碎；加入50%的水浸潤(rùn)。

1.2 產(chǎn)香細(xì)菌的篩選

1.2.1 產(chǎn)香細(xì)菌的分離

稱取5g粉碎均勻的大曲，放入裝有95 mL生理鹽水和少數(shù)玻璃珠的250 mL錐形瓶中，置于搖床振蕩30 min，得到大曲浸出液。將大曲浸出液作十倍梯度稀釋，取稀釋倍數(shù)為10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋液0.1 mL直接涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，分別采用常溫法(37 ℃的恒溫培養(yǎng)1～2 d)和高溫法(50 ℃的恒溫培養(yǎng)1～2 d)兩種方法進(jìn)行篩選，將長(zhǎng)勢(shì)良好且菌落形態(tài)有較大差異的細(xì)菌，劃線純化后在4 ℃下斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產(chǎn)香細(xì)菌的復(fù)篩

取初篩菌株接種于細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h即為細(xì)菌種子液。將細(xì)菌種子液按照10%的接種量添加至高粱小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照35 ℃→40 ℃→45 ℃→50 ℃→55 ℃進(jìn)行梯度升溫，每培養(yǎng)24 h升溫5 ℃，共培養(yǎng)5 d。對(duì)照組操作一致，但不接入細(xì)菌種子液。固態(tài)發(fā)酵完成后，將從酸味、醬味和異味等三個(gè)方面對(duì)菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行嗅聞感官評(píng)價(jià)，篩選出整體香氣協(xié)調(diào)，特征香味突出的菌株進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 菌種的鑒定

菌株形態(tài)及生理生化鑒定：對(duì)純化后單菌落的形態(tài)、顏色、大小進(jìn)行觀察。對(duì)菌種進(jìn)行革蘭氏反應(yīng)、V.P.反應(yīng)、7%NaCl 耐鹽生長(zhǎng)、厭氧生長(zhǎng)、淀粉水解等一系列試驗(yàn)，并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》加以對(duì)比鑒定。

16S rRNA序列同源性分析鑒定：按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作進(jìn)行基因組DNA的提取，并以27F和1492R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA6.0軟件建樹(shù)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

1.2.4 產(chǎn)香細(xì)菌的生長(zhǎng)特性研究

(1)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：將分離篩選出的產(chǎn)香細(xì)菌接種于細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取1次樣，空白對(duì)照為不接種的細(xì)菌液體培養(yǎng)基，于600 nm處測(cè)其OD值。

(2)耐受特性分析

以O(shè)D600為指標(biāo)，在原有細(xì)菌液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃)，pH值(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5)，酒精濃度(v/v)(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%)，NaCl濃度(m/v)(5%、8%、11%、14%、17%、20%、23%、26%)、葡萄糖濃度(m/v)(0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)5個(gè)因素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)情況的影響，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.2.5 產(chǎn)香細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味成分分析

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析檢測(cè)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。準(zhǔn)確稱取菌株固態(tài)發(fā)酵后的發(fā)酵產(chǎn)物樣品2 g，裝入5 mL頂空樣品瓶中，加入50 μL濃度為20 mg/100 mL的乙酸丁酯內(nèi)標(biāo)。平衡條件：溫度設(shè)為55 ℃，平衡時(shí)間為20 min，萃取時(shí)間為50 min。GC-MS分析條件設(shè)定按照參考文獻(xiàn)[8]。將檢測(cè)結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)庫(kù)中質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)，確定揮發(fā)性風(fēng)味成分，根據(jù)內(nèi)標(biāo)和各揮發(fā)性成分的峰面積數(shù)據(jù)，按峰面積歸一化法[9]計(jì)算出樣品中各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)香細(xì)菌的篩選

2.1.1 產(chǎn)香細(xì)菌的分離純化

通過(guò)稀釋涂布分離法，采用常溫法、高溫法兩種方法，對(duì)曲樣進(jìn)行平板菌落分離，從高溫大曲中共分離得到23株菌落形態(tài)上有較大差異的菌株，菌落形態(tài)描述見(jiàn)表1。

2.1.2 產(chǎn)香細(xì)菌復(fù)篩

將分離純化的23株菌株活化后，在無(wú)菌條件下接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 d，再按10%的接種量將其接種于高粱小麥固體培養(yǎng)基中，35 ℃→55 ℃梯度升溫，每培養(yǎng)24 h升5 ℃，共靜置培養(yǎng)5 d，根據(jù)感官評(píng)定，從中篩選出醬香風(fēng)味濃郁的菌株進(jìn)行GC-MS分析，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評(píng)定見(jiàn)表2。

表1 不同細(xì)菌菌落形態(tài)描述

由表2可以看出，不同的細(xì)菌在相同條件下固態(tài)發(fā)酵后呈現(xiàn)不同的感官。未接入細(xì)菌的對(duì)照組沒(méi)有一點(diǎn)醬味，只有一點(diǎn)點(diǎn)酸味和異味，由于小麥和高粱在蒸煮后又經(jīng)過(guò)高溫烘焙，本身存在一定的香氣，但并未產(chǎn)生醬香味。大多數(shù)細(xì)菌高溫固態(tài)發(fā)酵后產(chǎn)生醬味，但有些細(xì)菌不僅沒(méi)有醬味，還產(chǎn)生了強(qiáng)烈的異味，如XJ-8、XJ-17。XJ-12、XJ-15、XJ-16產(chǎn)醬香味大也有較大的酸味，沒(méi)有異味， 這可能是由于高溫大曲中的細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定的酸，同時(shí)酸也是醬香型白酒的一大特征。經(jīng)感官初步評(píng)定，篩選醬味較強(qiáng)，異味較小的XJ-12進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.1.3 細(xì)菌XJ-12的鑒定

對(duì)XJ-12進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化、分子鑒定，由圖1可知，菌落成不規(guī)則圓形，顏色為白色，邊緣不整齊，表面濕潤(rùn)，鏡檢形態(tài)為革蘭氏陽(yáng)性菌。生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，菌株在55 ℃下能生長(zhǎng)，7%NaCl環(huán)境中能生長(zhǎng)，兼性厭氧，試驗(yàn)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中地衣芽孢桿菌的生理生化特性基本一致[10]。

表2 產(chǎn)香細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵的感官評(píng)定

注：表中數(shù)字代表氣味強(qiáng)度，從0到10逐漸增強(qiáng)，0為最弱，10為最強(qiáng)。

圖1 細(xì)菌菌落形態(tài)和顯微形態(tài)圖

表3 細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)

注: + : 陽(yáng)性反應(yīng); - : 陰性反應(yīng)。

由圖2可知，XJ-12和地衣芽孢桿菌聚為一類，結(jié)合菌株形態(tài)、生理生化試驗(yàn)，初步鑒定XJ-12菌株為地衣芽孢桿菌，登錄號(hào)為MK859992。在高溫大曲的制作過(guò)程中，由于溫度的升高，氧氣含量相對(duì)減少，地衣芽孢桿菌等耐高溫、兼性厭氧的芽孢桿菌成為了高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)菌群[11]。

圖2 細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 產(chǎn)香細(xì)菌的生長(zhǎng)特性研究

(1)菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖3可知，該細(xì)菌生長(zhǎng)較為迅速，培養(yǎng)4 h后逐漸進(jìn)入對(duì)數(shù)期，18 h時(shí)OD600達(dá)到最大，此后菌株生長(zhǎng)較為平緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖3 細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線

(2)耐受特性分析

①耐溫性試驗(yàn)

高溫制曲發(fā)酵過(guò)程中，網(wǎng)羅富集了優(yōu)勢(shì)微生物，同時(shí)形成相應(yīng)的香味物質(zhì)[14]，研究菌株對(duì)溫度的耐受性，有助于篩選嗜溫微生物并合理有效地將其應(yīng)用到釀酒生產(chǎn)實(shí)踐中。由圖4可知，菌株能在30 ℃～40 ℃之間能較好地生長(zhǎng)，且在55 ℃左右也能生長(zhǎng)，耐溫性較好。

圖4 不同溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

②耐酸試驗(yàn)

由于發(fā)酵環(huán)境為酸性環(huán)境，發(fā)酵產(chǎn)酸快，pH較低，因此對(duì)釀酒微生物耐酸性要求較高，同時(shí)pH能改變微生物細(xì)胞中的電解質(zhì)，從而對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝造成一定影響[15]。由圖5可知，菌株在pH值大于4時(shí)均能較好生長(zhǎng)。當(dāng)pH值小于3.5，其生長(zhǎng)量明顯降低。

圖5 不同pH值對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

③耐酒精試驗(yàn)

酒精對(duì)細(xì)胞的抑制作用比較復(fù)雜，重點(diǎn)體現(xiàn)在它能夠抑制細(xì)菌的存活和增殖[16]。圖6可知，初始乙醇濃度越高，OD值越小，當(dāng)乙醇濃度在10%以上時(shí)，該菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制，對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響差異不顯著(P>0.05)，幾乎不生長(zhǎng)，該菌的最大耐酒精濃度為8%。

圖6 不同酒精濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

④耐鹽試驗(yàn)

由圖7可知，該菌株耐鹽能力較好，能在14%的NaCl濃度中生長(zhǎng)，在8%的NaCl濃度中OD值達(dá)到最大，菌株此時(shí)生長(zhǎng)情況最好；在當(dāng)鹽濃度高于17%時(shí)，對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響差異不顯著(P>0.05)，菌株生長(zhǎng)受到抑制[17]。

圖7 不同NaCl濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

⑤耐糖度試驗(yàn)

由圖8可知，初始糖濃度越高，OD值越小。當(dāng)初始糖濃度達(dá)到 30%時(shí)，該菌幾乎不生長(zhǎng)，對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響差異不顯著(P>0.05)。高濃度的糖通過(guò)影響細(xì)胞的滲透性對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制，該菌的最高耐糖度為25%，具有較好的耐受性。

圖8 不同糖度對(duì)細(xì)菌的影響

2.3 產(chǎn)香細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味成分分析

將XJ-12進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后，采用頂空固相微萃取法檢測(cè)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。XJ-12固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分共有39種，主要有2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯酚、苯乙醇、辛酸乙酯、乙偶姻、愈創(chuàng)木酚、正己酸乙酯，這些揮發(fā)性成分是組成醬香風(fēng)味的重要物質(zhì)。而有些成分則是固態(tài)發(fā)酵后特有的，如2,4,5,6-四氨基嘧啶33、2-癸酮、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、異丁酸乙酯、異戊醇等，在已有的研究中，這些成分在醬香型白酒中均有檢測(cè)到[18]。

表4 XJ-12固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味成分

由表4可知，XJ-12菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高，占總含量的15.96%，苯酚、苯乙醇等芳香族化合物含量較多，同時(shí)還有較高的乙偶姻和異戊酸、正丁醇。丁酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異丁酯等酯類化合物，占總含量的23.95%。在已有的高溫大曲產(chǎn)香細(xì)菌的研究中，其代謝產(chǎn)物以四甲基吡嗪為主要特性化合物，同時(shí)具有較高的乙偶姻，本研究中產(chǎn)香細(xì)菌XJ-12產(chǎn)吡嗪能力較強(qiáng)，這與相關(guān)研究相符合[19]。除此以外，XJ-12產(chǎn)生的酯類化合物也較為豐富，在白酒風(fēng)味形成中，這些酯類物質(zhì)也起著關(guān)鍵性作用。

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究通過(guò)稀釋涂布分離法，采用常溫法、高溫法兩種方法從高溫大曲中共分離得到23株菌落形態(tài)上有較大差異的菌株。通過(guò)感官嗅聞法，篩選得到XJ-12醬香最為突出，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化、分子鑒定初步鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌。研究了該菌的生長(zhǎng)耐受性，發(fā)現(xiàn)該菌生長(zhǎng)較為迅速，對(duì)溫度、鹽及糖度都有較好的耐受性。通過(guò)固態(tài)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌揮發(fā)性產(chǎn)物主要有2,3,5,6-四甲基吡嗪、乙偶姻、苯乙醇、苯酚、苯乙酸乙酯等，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高，占總含量的15.96%，同時(shí)酯類物質(zhì)含量也較為豐富。該地衣芽孢桿菌具有很好的耐受能力與產(chǎn)醬香能力，具有較好的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。