徐麗珊， 施恩琪， 王利枝， 陳佳靜， 韓高琦， 邵翌雪， 胡凱婕

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

早疫病和枯萎病可分別在番茄和黃瓜的整個生長發(fā)育時期發(fā)生，是2種重要的真菌性病害[1-2].番茄早疫病能使番茄減產(chǎn)35%～68%[3]；黃瓜枯萎病在重病年份的發(fā)病率可達到80%～90%[4].針對番茄早疫病及黃瓜枯萎病，目前生產(chǎn)上普遍采用代森錳鋅、多菌靈、異菌脲等化學(xué)殺菌劑來防治.但因長期大量使用，化學(xué)殺菌劑已經(jīng)擴散到大氣、水、土壤中，造成水源污染、土壤酸化、有機質(zhì)含量減少、有益的天敵和微生物死亡等一系列嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[5-6].同時，化學(xué)殺菌劑難降解、易殘留，易隨食物鏈在生物體內(nèi)富集，引發(fā)了食品安全問題，危及人類健康.隨著人們環(huán)保意識的增強和對食品安全的日益重視，對環(huán)境友好、安全可靠、經(jīng)濟高效的植物源殺菌劑受到了大眾的追捧，成為了農(nóng)藥研發(fā)的主要途徑之一.

一年蓬(E.annuus)為菊科飛蓬屬植物，是原產(chǎn)于北美的惡性雜草，由于其強大的入侵和適應(yīng)能力，該雜草已對入侵地的植物群落及環(huán)境造成了嚴(yán)重影響[7]，它是我國分布較廣、危害較大的入侵物種之一[8]；同時，一年蓬具有化感作用，能夠抑制入侵地的植物生長，并且少有天敵和病害.Velmurugan等[9]發(fā)現(xiàn)一年蓬花提取物對亞麻短桿菌和表皮葡萄球菌具有抑制效果.張應(yīng)烙等[10]研究表明，一年蓬丙酮提取物能顯著抑制楊樹潰瘍病菌及小麥紋枯病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā).實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，一年蓬對黑曲霉等真菌的生長具有較好的抑制效果.實驗以一年蓬為材料，研究其對番茄早疫病菌和黃瓜枯萎病菌的抑制活性，優(yōu)化從一年蓬中提取抑菌活性成分的最佳工藝，篩選高抑菌活性萃取相，為進一步研制環(huán)境友好、安全可靠、經(jīng)濟高效的一年蓬源殺菌劑奠定基礎(chǔ).研究為合理利用一年蓬，提高其附加值提供一種新思路，也為分離純化一年蓬功效單體化合物及深入探究其抑菌機理奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:一年蓬(E.annuus)、黃瓜枯萎病菌(F.oxysporium)及番茄早疫病菌(A.solani)(浙江師范大學(xué)微生物學(xué)實驗室提供)；70%可濕性粉劑(上海悅聯(lián)化工有限公司)等.

儀器:微波提取儀(金華市揚天貿(mào)易有限公司)；真空干燥箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱、恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);高壓蒸汽滅菌鍋(日本三洋電機株式會社);超凈工作臺、恒溫生化培養(yǎng)箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)等.

1.2 方 法

1.2.1 一年蓬活性成分的微波提取工藝優(yōu)化

1)單因素試驗

采集一年蓬洗凈后，60 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎.以水為提取溶劑，固定微波功率600 W，料液質(zhì)量濃度1∶40 g/mL，時間15 min，溫度分別為50,60,70,80 ℃，進行溫度的單因素試驗.以水為提取溶劑，料液質(zhì)量濃度1∶40 g/mL，時間為15 min，溫度60 ℃，微波功率分別為400,500,600,700,800 W，進行功率的單因素試驗.以水為提取溶劑，溫度 60 ℃，固定微波功率600 W，時間15 min，料液質(zhì)量濃度分別為1∶40,1∶50,1∶60,1∶70,1∶80 g/mL，進行料液質(zhì)量濃度的單因素試驗.以水為提取溶劑，溫度60 ℃，固定微波功率600 W，料液質(zhì)量濃度1∶40 g/mL，時間分別為3,6,9,12 min，進行時間的單因素試驗.

通過單因素試驗得到一年蓬提取液，采用菌絲生長速率法[11]測定其抑菌活性.抑菌率可由下式計算:

2)響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取3個對抑菌率影響較大的因素，借助Design-Expert 8.05b軟件設(shè)計響應(yīng)面[12]試驗，優(yōu)化一年蓬活性成分的微波提取工藝.

1.2.2 一年蓬高抑菌活性萃取相的確定

一年蓬依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取[13]，由最佳提取工藝得到各萃取相，將萃取相于45 ℃真空干燥至含水量≤5%，并粉碎成粉末.采用菌絲生長速率法，測定各萃取相(6 mg/mL)對黃瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制率，確定一年蓬高抑菌活性萃取相.

1.2.3 一年蓬高抑菌活性萃取相的功效驗證

1)平皿抑菌活性測定

采用二倍稀釋法[14]考察不同濃度一年蓬高抑菌活性萃取相和甲基硫菌靈(陽性對照)對黃瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑菌活性，確定其MIC和MBC[15]，并用SPSS軟件計算一年蓬高抑菌活性萃取相及甲基硫菌靈對2種病原菌的有效抑制半數(shù)濃度(EC50).

2)離體葉片抑菌活性測定

以黃瓜幼苗和番茄幼苗為載體，以離體抑菌實驗時一年蓬高抑菌活性萃取相和作為陽性對照的甲基硫菌靈的EC50值進行離體葉片實驗[16-17]，以驗證其活體預(yù)防效果及治療效果.

預(yù)防效果：將生長狀態(tài)相似、長勢較好的幼苗相同部位葉片用刀片在葉柄處快速切下，并在規(guī)定濃度的提取物藥液中浸漬3～5 s后自然晾干，葉柄用濕潤的吸水脫脂棉包裹保濕，空白對照以清水處理，每組重復(fù)3次，每次處理3片葉；藥液處理1 d后在葉片中脈處接種病原菌菌餅；培養(yǎng)6 d后，按式(1)～式(2)計算預(yù)防效果.

治療效果：將生長狀態(tài)相似、長勢較好的幼苗相同部位葉片用刀片在葉柄處快速切下，在葉片中脈處接種病原菌菌餅，葉柄用濕潤的吸水脫脂棉包裹保濕，每組重復(fù)3次，每次處理3片葉；接菌培養(yǎng)1 d后噴灑處理液，空白對照以清水處理；培養(yǎng)6 d后，按式(1)～式(2)計算治療效果.

(1)

(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，0.01≤P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 一年蓬活性成分的微波提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗

單因素考察溫度、微波功率、料液質(zhì)量濃度及時間對一年蓬提取液抑菌活性的影響，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，分別在溫度60 ℃、微波功率500 W、料液質(zhì)量濃度1∶60 g/mL、時間6 min時，一年蓬提取液對黃瓜枯萎病菌的抑制率最大.

圖1 各因素對一年蓬抑制黃瓜枯萎病菌活性成分提取的影響

2.1.2 響應(yīng)面試驗

由2.1.1可知，溫度、料液質(zhì)量濃度、提取時間對活性成分提取影響較大，微波功率影響較小.因此,以功率500 W為固定提取條件，以時間(A)、料液質(zhì)量濃度(B)、溫度(C)為響應(yīng)面擬合因素.利用Design-Expert 8.05b軟件設(shè)計3因素3水平共17 個實驗點，并根據(jù)公式統(tǒng)計分析得如下二次響應(yīng)面回歸模型：

抑菌率(%)=25.89+0.45A-1.97B-0.52C-1.22AB-1.75AC-1.29BC-4.92A2-6.38B2-4.20C2.

圖2 各因素交互作用影響黃瓜枯萎病菌抑制率的曲面圖和等高線圖

其中A，B，C3個因素之間的交互效應(yīng)如圖2所示.分析圖2可知，3個曲面均較陡，3個等高線圖均呈橢圓形，說明該響應(yīng)面各因素間交互效應(yīng)較強.此外，回歸方程模型F檢驗為顯著(P<0.05)，其決定系數(shù)R2=0.870 4>0.8，說明該方程模擬真實的三因子水平分析是可行的.利用軟件分析得到的最佳提取條件為：時間6.31 min、料液質(zhì)量濃度1∶59.45 g/mL、溫度59.19 ℃.預(yù)測在此條件下抑制率為26.02%.結(jié)合實際操作中的局限性，確定最后修正的工藝條件為：時間6 min、料液質(zhì)量濃度1∶60 g/mL、溫度60 ℃.在此條件下，進行3組平行實驗驗證，得其對黃瓜枯萎病菌的抑菌率為(25.89±0.56)%，與預(yù)測值相符.

2.2 一年蓬高抑菌活性萃取相的確定

測定一年蓬各萃取相對黃瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌的抑制率，結(jié)果如表1所示.其中,一年蓬乙酸乙酯相對2種病原菌的抑制率極顯著地高于其他萃取相(P<0.01)，因此，確定一年蓬乙酸乙酯相為高活性萃取相.

表1 一年蓬各萃取相對黃瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌的抑菌活性

2.3 一年蓬高抑菌活性萃取相的功效驗證

2.3.1 平皿抑菌活性測定

不同濃度一年蓬乙酸乙酯相及甲基硫菌靈對2種病原菌的抑制率見表2和表3.由該濃度梯度實驗結(jié)果可知，一年蓬乙酸乙酯相對黃瓜枯萎病菌的MIC為0.75 mg/mL，對番茄早疫病菌的MIC為1.50 mg/mL，對2種病原菌的MBC皆為36 mg/mL，其中一年蓬乙酸乙酯相對番茄早疫病菌的MBC遠小于甲基硫菌靈(112 mg/mL).

表2 一年蓬乙酸乙酯相對黃瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制率

2.3.2 離體葉片抑菌活性測定

一年蓬乙酸乙酯相及甲基硫菌靈對黃瓜枯萎病和番茄早疫病的活體預(yù)防效果和治療效果見表4，實物照片如圖3所示.由表4及圖3可知，一年蓬乙酸乙酯相對2種病害均具有較好的預(yù)防和治療效果，其中一年蓬乙酸乙酯相對2種病原菌的治療效果均顯著優(yōu)于甲基硫菌靈(P<0.05).

3 討 論

本實驗以一年蓬為原料，對黃瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制率為指標(biāo)，經(jīng)單因素和響應(yīng)面實驗優(yōu)化得到從一年蓬中提取抑菌活性成分的最佳工藝；一年蓬提取物的乙酸乙酯相對黃瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌的抑制率均較高，活體實驗(離體葉片法)表明其對2種病害均具有較好的預(yù)防和治療效果.一年蓬為分布廣泛的入侵植物，常生于路邊曠野或山坡荒地，資源非常豐富，目前利用率很低，一年蓬安全無毒，其嫩莖葉可以作為天然綠色食品食用[18].因此，若以一年蓬提取物的乙酸乙酯相為主要成分進一步開發(fā)成植物源殺菌劑，則原料豐富易得、生產(chǎn)成本較低、對環(huán)境友好、有助于維持生態(tài)平衡；另一方面，如果以此開發(fā)出的殺菌劑能在一定范圍內(nèi)取代難降解、易擴散、污染環(huán)境的化學(xué)殺菌劑，對環(huán)境也會起到很好的保護作用，同時可以有效地緩解由化學(xué)殺菌劑引發(fā)的食品安全問題.研究也為后續(xù)實驗分離主要功效單體化合物探究抑菌機理，并將其作為先導(dǎo)化合物開發(fā)更高效的殺菌劑奠定基礎(chǔ).

表3 甲基硫菌靈對黃瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制率

表4 一年蓬乙酸乙酯相對黃瓜枯萎病及番茄早疫病的活體防治效果

圖3 一年蓬乙酸乙酯相對黃瓜枯萎病及番茄早疫病的活體防治效果