吳佳璟，朱文妍，孫亦農(nóng)，朱世鵬

逆針灸是針灸的一種，“逆”指未至而迎之，屬于針灸中的“未病先防”，是指在疾病還未發(fā)生或是即將要發(fā)生之前預(yù)先予以針刺治療，激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣以預(yù)防疾病的發(fā)生或者減輕疾病的程度。肥胖是多種疾病如糖尿病、心血管疾病、癌癥等的危險因素，對于肥胖的預(yù)防和治療一直是臨床研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。大量研究證實(shí)針灸在肥胖的治療上有獨(dú)特的優(yōu)勢［1］，然而逆針灸對肥胖是否有預(yù)防作用及其可能的相關(guān)機(jī)制尚未可知。本研究擬通過觀察逆針“豐隆穴”對大鼠肥胖、瘦素抵抗以及脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增值物激活受體γ（PPAR-γ）水平的影響，探討逆針灸防治肥胖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 實(shí)驗(yàn)時間：2016年5—7月。4周齡SPF級雄性大鼠24只，體質(zhì)量110～120 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，隨機(jī)分為模型組、逆針組和空白組，每組8只。明暗周期12 h，自由飲食和飲水，環(huán)境溫度24 ℃，濕度40%～50%，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，模型組和逆針組進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)，空白組進(jìn)行普通飼料喂養(yǎng)，為期12周（全部飼料由江蘇省協(xié)同生物有限公司提供）。以大鼠體質(zhì)量超過空白組20%為肥胖標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)過程遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會要求進(jìn)行。

1.2 主要儀器與試劑 臺式普通離心機(jī)以及臺式低溫冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），實(shí)時熒光定量PCR儀器（Applied Biosystems公司），多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司），組織勻漿機(jī)（上海凈信科技有限公司），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS公司），ELISA試劑盒（南京拓輪生物科技有限公司），IP細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），qPCR Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司），引物訂購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 干預(yù)方法 將逆針組大鼠固定在自制固定器上，待大鼠平靜后，用碘伏消毒雙側(cè)“豐隆”穴區(qū)域，使用一次性一寸長針灸針，手持柄垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度7 mm，留針20 min。干預(yù)在造模開始的同時進(jìn)行，每周干預(yù)3次，持續(xù)進(jìn)行12周?？瞻捉M和模型組同步抓取固定，不干預(yù)。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

首次觀察了逆針灸對于高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肥胖的預(yù)防作用，并從分子角度揭示了逆針灸對肥胖預(yù)防的機(jī)制，可能與其使機(jī)體對瘦素的敏感性升高，同時減少能量攝取，促進(jìn)脂肪分解有關(guān)，且對預(yù)防肥胖有一定價值。

本研究局限性：

本研究觀察周期較短，逆針灸對肥胖的預(yù)防是否具有長時間的持續(xù)作用，有待進(jìn)一步觀察。此外，今后研究應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注不同的針刺刺激量產(chǎn)生的效應(yīng)是否存在差異。

1.4 取材及檢測指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量 干預(yù)期間每周測量并記錄各組大鼠的體質(zhì)量。

1.4.2 標(biāo)本采集 10%水合氯醛麻醉后，采用腹主動脈采血法每只取血 5 ml，3 000 r/min 離心 15 min（離心半徑 16 cm），分離血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。之后迅速分離腎周脂肪組織稱重，將部分腎周脂肪組織置于10%甲醛固定液中固定，剩余脂肪組織用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中待測。

1.4.3 脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將固定于10%甲醛固定液中的脂肪組織用石蠟包埋切片，并做常規(guī)HE染色。于20倍光學(xué)顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)。然后用Image-ProPlus 6.0軟件分析脂肪細(xì)胞面積圖片，每組切片隨機(jī)挑選3個200倍視野進(jìn)行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件，使用不規(guī)則選圖工具，每張照片中隨機(jī)圈出5個脂肪細(xì)胞，測出單個脂肪細(xì)胞面積，并求出每張切片中脂肪細(xì)胞的平均面積。

1.4.4 ELISA法檢測血清瘦素水平 取出-80 ℃冰箱中保存的血清，按照ELISA試劑盒中產(chǎn)品說明書上的步驟進(jìn)行檢測。

1.4.5 qPCR檢測脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ水平 每組隨機(jī)選擇3個脂肪樣本分別稱取脂肪組織100 mg，按步驟進(jìn)行RNA的提取，用BioPhotometer生物分光光度計(jì)檢測提取的RNA樣品濃度及純度，取1 μg RNA 為模板，按照日本TOYOBO 公司的 ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系：5×RT Buffer 4 μl，Primer Mix 1 μl，RT Enzyme Mix 1 μl，RNA 1 μg，DEPC Water 20 μl。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 20 min，40 個周期；98 ℃ 5 min，40個周期。qPCR按照南京諾維贊公司的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 產(chǎn)品說明書進(jìn)行，引物序列見表1，之后放在ABI qPCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果由ABI qPCR儀相應(yīng)的 Step One Software v2.1 軟件分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量 干預(yù)前、干預(yù)第4周3組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)第8周，3組大鼠體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組大鼠體質(zhì)量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)第12周，3組大鼠體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組、逆針組大鼠體質(zhì)量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；逆針組大鼠體質(zhì)量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 腎周脂肪組織重量 3組大鼠腎周脂肪組織重量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。模型組、逆針組大鼠腎周脂肪組織重量大于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；逆針組大鼠腎周脂肪重量小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.3 脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué) 模型組大鼠脂肪細(xì)胞面積較空白組大鼠明顯增大，細(xì)胞壁較薄，細(xì)胞大小不均勻，新生脂肪細(xì)胞較多。逆針組大鼠脂肪細(xì)胞較模型組明顯面積減小，細(xì)胞大小較為均勻，新生脂肪細(xì)胞較小，但是較空白組脂肪細(xì)胞面積仍略大。3組大鼠脂肪細(xì)胞平均面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組大鼠脂肪細(xì)胞平均面積大于空白組、逆針組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖1、表4）。

2.4 血清瘦素水平 3組大鼠血清瘦素水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）。模型組大鼠血清瘦素水平高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；逆針組大鼠血清瘦素水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見表5）。

2.5 脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ表達(dá)水平 3組大鼠脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組大鼠脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ表達(dá)水平高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；逆針組大鼠脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表6）。

3 討論

大量研究已證實(shí)，針灸在機(jī)體多種疾病狀態(tài)下有較為顯著的治療作用，其對肥胖的治療效果也較為明確［1-3］。而隨著醫(yī)學(xué)關(guān)注對象逐漸從“已病”轉(zhuǎn)向“未病”，逆針灸“治未病”的預(yù)防思想越來越被重視，而逆針灸也被證實(shí)可以預(yù)防多種疾病狀態(tài)［4］。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著升高、腎周脂肪組織重量顯著增加、脂肪細(xì)胞面積明顯增大，新生脂肪細(xì)胞較多，說明高脂飲食造成了大鼠的肥胖以及脂肪異常堆積狀態(tài)。與模型組相比，干預(yù)第8周時逆針“豐隆”穴對體質(zhì)量的影響還沒有明顯效果；干預(yù)第12周時，逆針組體質(zhì)量較模型組明顯降低，說明逆針“豐隆”穴針刺效應(yīng)積累到一定程度，可以顯著改善高脂飲食引起的體質(zhì)量增加。12周干預(yù)結(jié)束后，逆針組大鼠的腎周脂肪組織重量較模型組減少，與此同時，逆針“豐隆”穴還能明顯改善脂肪細(xì)胞的病理形態(tài)，縮小脂肪細(xì)胞的體積，抑制脂肪細(xì)胞的新生。因此，逆針“豐隆”穴可能通過促進(jìn)內(nèi)臟脂肪的分解、改善脂肪的分布和異常堆積、恢復(fù)脂肪細(xì)胞正常形態(tài)來減預(yù)防和延緩肥胖的發(fā)生發(fā)展，其效應(yīng)的發(fā)揮需要一定程度的針刺刺激量積累。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR primer sequences for PPAR-γ andβ-actin

表2 3組大鼠不同時間體質(zhì)量比較（x±s，g）Table 2 Comparison of the body weight between 3 groups of rats before intervention，and at the end of the 4th，8th and 12th weeks of intervention

表3 3組大鼠腎周脂肪組織重量比較（x±s，g）Table 3 Comparison of the perirenal fat weight in 3 groups of rats

圖1 3組大鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)（HE染色，×200）Figure 1 Morphology of adipocytes in 3 groups of rats

表4 3組大鼠脂肪細(xì)胞平均面積比較（x±s，mm2）Table 4 Comparison of the average area of adipocytes in 3 groups of rats

表5 3組大鼠血清瘦素水平比較（x±s，ng/ml）Table 5 Comparison of the serum leptin level between 3 groups of rats

表6 3組大鼠脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ表達(dá)水平比較（n=3，x±s）Table 6 Comparison of the expression level of PPAR-γ in the adipose tissue in 3 groups of rats

瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪組織源激素，作用于大腦特別是下丘腦的傳入信號，通過調(diào)節(jié)食物攝取和能量消耗來協(xié)調(diào)能量平衡［5］。瘦素不僅可以抑制食欲，增加能量的消耗，還可以抑制脂肪的合成，從而調(diào)控脂肪的沉積。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肥胖機(jī)體體內(nèi)并不缺少瘦素，并且血瘦素含量與BMI呈正相關(guān)，說明機(jī)體對瘦素的反應(yīng)減弱，稱為瘦素抵抗［6］。大多數(shù)高脂飲食會引起血液中瘦素水平升高［6-7］，高瘦素血癥引起的瘦素向大腦轉(zhuǎn)運(yùn)減少是瘦素抵抗發(fā)展的關(guān)鍵因素［8］。本研究結(jié)果顯示，模型組血清瘦素水平高于空白組，說明高脂飲食造成大鼠肥胖狀態(tài)的同時，升高了血清瘦素水平，出現(xiàn)瘦素抵抗。既往研究發(fā)現(xiàn)，在機(jī)體存在瘦素抵抗時，常會伴有脂肪細(xì)胞數(shù)量增多、體積增大，導(dǎo)致脂肪的異常堆積［9］。本研究細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也符合這一表現(xiàn)。在機(jī)體瘦素抵抗?fàn)顟B(tài)下，補(bǔ)充瘦素并不能治療肥胖［10］。因此，如何改善瘦素抵抗，是研究關(guān)注的重點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，針灸作為治療肥胖的有效療法，在改善瘦素抵抗方面具有一定的作用。如有研究認(rèn)為針灸可以降低肥胖大鼠血清瘦素水平，增加下丘腦瘦素受體水平，調(diào)節(jié)肥胖機(jī)體血清高瘦素狀態(tài)，改善肥胖大鼠的瘦素抵抗?fàn)顟B(tài)［11］；而逆針灸可以改善大鼠更年期瘦素抵抗，從而預(yù)防和延緩更年期的卵巢功能減退和脂肪異常堆積［12］。最新研究發(fā)現(xiàn)，與口服抑制食欲藥物、飲食療法或者鍛煉相比，針灸可以更顯著地改善肥胖患者的瘦素抵抗［13］。本研究首次觀察了逆針“豐隆”穴對高脂飲食大鼠瘦素抵抗的影響，結(jié)果顯示：經(jīng)過逆針“豐隆”穴預(yù)防性治療后，大鼠血清瘦素水平較模型組大鼠明顯降低，說明逆針“豐隆”穴可以緩解血清高瘦素狀態(tài)，改善高脂飲食誘導(dǎo)的瘦素抵抗。

PPARs最初由英國科學(xué)家ISSEMANN等［14］于1990年首次發(fā)現(xiàn)，可分為α、β、γ 3種亞型［15］。PPAR-γ主要在脂肪組織中表達(dá)，是脂肪細(xì)胞分化和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其不僅能夠調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化、增加脂肪細(xì)胞的數(shù)量，還能調(diào)控脂肪細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與脂肪代謝、影響脂肪細(xì)胞的分泌［16］。因此PPAR-γ與肥胖的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。CHEN等［17］研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可引起大鼠肝臟PPAR-γ表達(dá)水平升高；LESTARI等［18］的研究證實(shí)，高脂飲食可引大鼠內(nèi)臟脂肪組織PPAR-γ表達(dá)水平增高。本研究結(jié)果顯示，模型組脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ水平高于空白組，表明高脂飲食造成了大鼠內(nèi)臟脂肪PPAR-γ表達(dá)的上調(diào)，與相關(guān)研究結(jié)果一致［18］。基于PPAR-γ促進(jìn)脂肪生成的作用，既往研究證實(shí)通過抑制PPAR-γ可以治療肥胖［19］。本研究結(jié)果顯示：逆針組大鼠脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ水平低于模型組，表明逆針“豐隆”穴可以降低高脂飲食大鼠脂肪組織中PPAR-γ的表達(dá)，推測這一調(diào)節(jié)作用可能是逆針“豐隆”穴可以減少脂肪合成，抑制脂肪分化，最終恢復(fù)其正常代謝的重要途徑。

綜上，逆針“豐隆”穴使大鼠對瘦素的敏感性升高，對下丘腦攝食中樞產(chǎn)生作用，減少能量的攝取，促進(jìn)脂肪分解，是其預(yù)防肥胖的重要途徑之一。逆針“豐隆”穴可以有效預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)大鼠的脂肪代謝異常，其機(jī)制可能與改善瘦素抵抗及調(diào)節(jié)脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的表達(dá)有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：朱世鵬進(jìn)行研究的設(shè)計(jì)與實(shí)施，文章審校；吳佳璟撰寫論文；吳佳璟、朱文妍進(jìn)行研究實(shí)施、評估、資料收集；孫亦農(nóng)進(jìn)行質(zhì)量控制。

本文無利益沖突。