吳思，吳盈盈，于淼，王爽，崔暢婉，孫崢嶸

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫，沈陽 110004）

宮頸癌在全球范圍內(nèi)流行，最近新公布的數(shù)據(jù)顯示每年大約有265 672例女性死于宮頸癌，并且每年新增病例大約為527 624例［1］。持續(xù)的高危型人類乳頭瘤病毒 （human papilloma virus，HPV） 作用會導(dǎo)致宮頸病變乃至宮頸癌的發(fā)生［2］。為了建立持續(xù)感染，HPV必須通過先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)來逃避監(jiān)視，調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)的主要途徑之一是Janus激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 （Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK/Stats） 途徑。有研究［3］顯示，HPV入侵宮頸細胞后可激活JAK/Stats通路，這對HPV的復(fù)制十分重要。

JAK/Stats通路中主要成員是Stat家族蛋白，由7個成員組成，包括Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b以及Stat6，其中Stat5a和Stat5b對于細胞的分化、凋亡、癌變以及免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用［4-5］。小鼠中Stat5a和Stat5b由11號染色體轉(zhuǎn)錄［4］，他們擁有超過94%的同源結(jié)構(gòu)，均含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及Src同源2結(jié)構(gòu)域。Stat5a和Stat5b分別在Src同源結(jié)構(gòu)域中第694和699位氨基酸進行酪氨酸磷酸化［4］，磷酸化后可形成同源或者異源二聚體遷移至胞核與下游DNA結(jié)合，進而參與對下游基因的調(diào)控［6］。Stat5a和Stat5b盡管同源，但具有不同的功能，其中Stat5a缺失會使乳腺細胞發(fā)育受損，而Stat5b則與性別發(fā)育、癌細胞分化有關(guān)［7-8］。另一方面，Stat5b作為Stat5的主要亞型［3］，其在細胞中的含量遠遠高于Stat5a，主要參與免疫炎癥反應(yīng)，調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡。本研究主要檢測Stat5b以及其磷酸化形式p-Stat5b在宮頸病變中的表達變化，分析Stat5b和p-Stat5b與宮頸病變之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取 2011年1月至2016年12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院進行宮頸活檢或者宮頸癌手術(shù)的患者標(biāo)本，病理診斷分別為正常、低度鱗狀上皮內(nèi)病變 （low-grade squamous intraepithelical lesion，LSIL） 、高度鱗狀上皮內(nèi)病變 （high-grade squamous intraepithelical lesion，HSIL） 以及宮頸癌的宮頸組織石蠟切片，每組標(biāo)本各20例，總計80例標(biāo)本。

入選標(biāo)準(zhǔn)： （1） 常規(guī)病理 HE 組織切片需得到至少 2 名有經(jīng)驗的病理學(xué)醫(yī)師的一致診斷； （2）診斷必須符合組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者年齡為35～60歲，平均年齡43歲。

1.2 試劑和儀器

Stat5b （產(chǎn)品貨號：135300） 、p-Stat5b （產(chǎn)品貨號：PA538093） 購 自 美 國Thermo Fisher Scientific公司；PBS 磷酸鹽緩沖液 （產(chǎn)品編號：ZLI-9062） 、檸檬酸修復(fù)液 （產(chǎn)品編號：ZLI-9064） 、抗體稀釋液 （產(chǎn)品編號：ZLI-9030） 、生物素標(biāo)記二抗試劑盒 （產(chǎn)品編號：SP-9000） 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。用已知陽性標(biāo)本進行檢測，以PBS代替一抗作為陰性對照。主要儀器有組織脫水機 （ASP200S，德國Leica公司） 、石蠟包埋機 （ThermoHistoStarTM，美國Thermo Fisher Scientific公司） 、石蠟組織切片機（Leica RM2245，德國Leica公司） 、高壓鍋 （YS24ED，中國蘇泊爾公司） 等。

1.3 實驗方法

檢測標(biāo)本來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫保存的正常宮頸組織及宮頸病變組織石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)方法檢測Stat5b和p-Stat5b的表達。主要步驟： （1） 標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，所有標(biāo)本連續(xù)切片5 張，厚度為3 μm，收至玻片，入58 ℃烤箱中烘干溶蠟3 h； （2） 石蠟組織切片脫蠟水化 （機械自動脫蠟） ； （3） 經(jīng)pH6.0檸檬酸修復(fù)液高溫高壓修復(fù)，高壓鍋噴氣時開始計時，Stat5b修復(fù)時間為2 min，p-Stat5b修復(fù)時間為5 min； （4） 滴加過氧化氫阻滯劑20 min，減少非特異性結(jié)合； （5） 一抗孵育：Stat5b、p-Stat5b抗體均按1∶200稀釋為工作濃度，置于 4 ℃冰箱孵育過夜； （6） 滴加生物素標(biāo)記的二抗，常溫孵育30 min； （7） 滴加DAB顯色； （8） 蘇木精復(fù)染細胞核； （9） 中性樹膠封片劑封片，顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判讀方法

選取400倍視野下進行評分。染色強度分數(shù)定義：陰性，0分；弱陽性，1分；中等陽性，2分；強陽性，3分。染色面積定義為5個等級：＜5%，0分；5%～25%，1分；＞25%～50%，2分；＞50%～75%，3分；＞75%，4分。評分范圍在0～12分：0～6分為低表達，7～12分為高表達。每張組織在400倍視野下選取4～5個視野，對其評分結(jié)果取均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

利用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，蛋白表達水平與宮頸病變程度的比較采用Spearman相關(guān)性分析，病變組間蛋白陽性率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn) α=0.05。用Graphprism5.0繪制箱式圖。

2 結(jié)果

2.1 Stat5b的表達與宮頸病變程度的相關(guān)性分析

對80例宮頸組織切片進行Stat5b免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果顯示隨著宮頸病變的進展Stat5b蛋白表達水平逐漸升高 （圖1A） 。20例正常宮頸組織中僅3例為高表達 （15.0%，3/20） ，而在LSIL組織中未見高表達 （0.0%，0/20） ，與正常組織相比略有下降，HSIL和宮頸癌組織中Stat5b的表達增加，其高表達比例分別為50.0% （10/20）和80.0% （16/20） 。Spearman相關(guān)性分析顯示，Stat5b蛋白表達水平與宮頸病變程度呈正相關(guān) （r = 0.570，P ＜ 0.001） （圖1B） 。按疾病的進展程度分為正常/低度病變和高度病變/宮頸癌，其中Stat5b在正常/低度病變組織中高表達比例為7.5% （3/40） ，在高度病變/宮頸癌高表達比例為65.0% （26/40） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （χ2=26.180，P ＜0.001） （圖1C） 。

2.2 p-Stat5b的表達隨著宮頸病變程度的升高而降低

圖1 Stat5b在宮頸組織中的表達Fig.1 The expression of Stat5b in cervical tissues

對80例標(biāo)本進行p-Stat5b免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果顯示p-Stat5b蛋白表達水平隨著宮頸病變程度的升高而降低 （圖2A） 。20例正常標(biāo)本中16例為p-Stat5b高表達 （80.0%，16/20） ，LSIL組織中p-Stat5b高表達比例為45.0% （9/20） 。隨著宮頸病變的進展，HSIL組織中p-Stat5b高表達比例僅為5.0% （1/20） ，同時對20例宮頸癌組織進行研究，發(fā)現(xiàn)p-Stat5b在宮頸癌中均無高表達 （0.0%，0/20） 。Spearman相關(guān)性分析顯示，pStat5b蛋白表達水平與宮頸病變程度呈負相關(guān) （r = -0.668，P ＜ 0.001） （圖2B） 。按疾病的進展程度分為正常/低度病變和高度病變/宮頸癌，其中p-Stat5b在正常/低度病變組織中高表達比例為62.5% （25/40） ，在高度病變/宮頸癌高表達比例為2.5% （1/40） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （χ2=30.142，P ＜0.001） （圖2C） 。

3 討論

Stat5是潛在的細胞質(zhì)蛋白，由2種高度同源的同種型Stat5a和Stat5b組成［9］。Stat5基因已被證明在癌變過程中發(fā)揮重要作用，因為它參與促進細胞周期進程、細胞轉(zhuǎn)化和預(yù)防細胞凋亡［10］。與其他Stat家族成員一樣，Stat5通過磷酸化特定的酪氨酸殘基而被激活，之后磷酸化的Stat5蛋白發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)位至細胞核以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［11］。有研究［12］證明，在前列腺癌中，Stat5的組成性活化與組織學(xué)分級和早期疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。

圖2 p-Stat5b在宮頸組織中的表達Fig.2 Expression of p-Stat5b in cervical tissues

本研究中，Stat5b隨著宮頸病變的進展表達逐漸升高，這與SOBTI等［13］的研究結(jié)果相似，即大多數(shù)宮頸癌病例中觀察到Stat5b表達水平升高，且Stat5b的過度表達也與宮頸癌病變的嚴(yán)重程度有關(guān)。這一結(jié)果在肝細胞癌的研究中也成立，表明Stat5b的表達與晚期腫瘤和癌細胞的侵襲行為顯著相關(guān)［14］。SUMIYOSHI等［15］在胰腺癌的研究中也得到相似的結(jié)果，研究顯示Stat5b在導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性良性腺瘤中不表達，在交界性導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤中表達較高，且隨著疾病進展，Stat5b在胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腺癌中表達最高，其研究結(jié)果表明Stat5b蛋白可能促進導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤的細胞增殖和進展。結(jié)腸癌細胞研究［16］中也證明了Stat5b蛋白的表達與TNM分期有關(guān)，且隨著分期的升高表達量增加，該研究也表明Stat5b可能通過減少Bcl-2和生存素的表達，對結(jié)腸癌的進展產(chǎn)生影響。頭頸部鱗狀細胞癌研究［17］顯示，阻斷Stat5b可導(dǎo)致其下游靶基因cyclin D1和Bcl-xL的表達下調(diào)，上述靶基因促進細胞周期停滯，最終導(dǎo)致細胞凋亡，進而證明了Stat5b與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療息息相關(guān)。因此，宮頸癌與Stat5b關(guān)系的研究有助于明確Stat5b在宮頸癌中發(fā)揮的作用，為以后宮頸癌的診斷及預(yù)后提供新的生化指標(biāo)。

本研究還發(fā)現(xiàn) p-Stat5b的表達在宮頸病變進展過程中逐漸降低，在宮頸癌病例中低表達或不可檢測。高危型HPV是宮頸病變發(fā)生及進展的主要病因，在幾乎所有的宮頸癌細胞中均能檢測HPV DNA的存在［18-19］。HONG等［20］在人類包皮上皮細胞中轉(zhuǎn)染HPV病毒，并誘導(dǎo)其表達E6、E7蛋白，發(fā)現(xiàn)在有E6蛋白表達時p-Stat5b表達下降，由此推斷E6蛋白可能導(dǎo)致p-Stat5b下降。Stat5b是Stat5的主要組成成員，在磷酸化水平上p-Stat5b也占據(jù)其主要成分，在宮頸組織中p-Stat5b的下降也可能與E6蛋白的表達有關(guān)［4］。此外有研究報道，宮頸病變進展是HPV基因組與宿主基因整合的結(jié)果［21］，且隨著宮頸病變程度的升高整合細胞所占比例也逐漸升高［22］。HPV整合可以分為2種類型：一種是單個基因組整合到細胞DNA中；另外一種是基因組的多個串聯(lián)頭對尾重復(fù)序列在某些情況下插入細胞的側(cè)翼序列［23］。以上2種整合方式都可驅(qū)動致癌基因E6、E7的強表達［24］，進而使p-Stat5b表達下降。

綜上所述，Stat5b和p-Stat5b與宮頸病變的進展有關(guān)，且p-Stat5b的表達可能受致癌基因E6表達的影響，本研究對闡釋宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制具有指導(dǎo)意義，為宮頸病變的早期診斷及篩查提供新的手段，亦可能為未來宮頸癌的治療提供新的靶點。