李漢文，劉玲玲，李亙松，朱鑠同，李春雨，鄧欣

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第四醫(yī)院肛腸外科，沈陽(yáng) 110032；2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；3. 附屬第四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110032）

未成熟卵細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) （in vitro maturation，IVM） 技術(shù)已應(yīng)用多年，但目前IVM后受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率低下，妊娠率僅為20%～30%，且流產(chǎn)率較高［1］。IVM的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)環(huán)境還不夠完善，卵母細(xì)胞發(fā)展成熟機(jī)制仍在不斷探索中。小鼠卵母細(xì)胞取材的質(zhì)量與數(shù)量對(duì)于更好地研究卵母細(xì)胞成熟機(jī)制非常重要。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞從卵巢卵泡中釋放后，自發(fā)地恢復(fù)減數(shù)分裂。在第一次減數(shù)分裂之前，卵母細(xì)胞從萌發(fā)囊泡 （germinal vesicle，GV）到胚泡破裂 （germinal vesicle break down，GVBD） 經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，即雙線期阻滯釋放進(jìn)程［2］。GVBD是核分離的開始，它是減數(shù)分裂過程中的第一個(gè)重要事件，也是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志［3］，這一階段卵母細(xì)胞培養(yǎng)的效果至關(guān)重要。因此，本研究擬探討油封M2液滴培養(yǎng)與傳統(tǒng)M16培養(yǎng)對(duì)GV期至GVBD期 （即雙線期阻滯釋放期間） 卵母細(xì)胞的形態(tài)及生存率的影響。

二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO） 是一種雙極性溶劑，為常用的藥物溶媒，具有膜親和力高的特點(diǎn)，可協(xié)助脂溶性藥物透過細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)藥物的吸收利用。但DMSO具有細(xì)胞毒性，在細(xì)胞培養(yǎng)中超過一定劑量后會(huì)對(duì)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和凋亡產(chǎn)生影響［4］，控制好DMSO的濃度劑量對(duì)細(xì)胞藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重要的影響。因此，本研究擬探索不同濃度的DMSO對(duì)雙線期阻滯釋放期間卵母細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SPF級(jí)KM雌鼠，3周齡，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。M2、M16培養(yǎng)液、礦物質(zhì)油和DMSO購(gòu)自中國(guó)上海Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠卵母細(xì)胞的分離：頸椎脫臼法處死雌鼠。取出卵巢，用2個(gè)1 mL注射器在M2培養(yǎng)液中將小鼠卵巢挑破，顯微鏡下反復(fù)沖洗，游離出裸露的GV期卵母細(xì)胞。

1.2.2 培養(yǎng)微滴的制備：用50 μ L移液器在35 mm無菌塑料組織培養(yǎng)皿的底部做20個(gè)規(guī)則排列的30 μ L M16培養(yǎng)微滴，用于直接培養(yǎng)卵母細(xì)胞 （M16組） 。用同樣方法制備20滴30 μ L M16培養(yǎng)微滴，然后立即在培養(yǎng)微滴上覆蓋礦物質(zhì)油，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡 （油封M16組） ，次日用于培養(yǎng)卵母細(xì)胞［5］。用同樣方法制備20滴30 μ L M2培養(yǎng)微滴，立即在培養(yǎng)微滴上覆蓋礦物質(zhì)油，用于直接培養(yǎng)卵母細(xì)胞 （油封M2組） 。

1.2.3 卵母細(xì)胞在不同培養(yǎng)微滴中的分組培養(yǎng)及觀察：取分離的卵母細(xì)胞，隨機(jī)分為60組，每組30個(gè)，在顯微鏡下將60組卵母細(xì)胞隨機(jī)置入3種各20滴的培養(yǎng)微滴中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h。顯微鏡下觀察每組卵母細(xì)胞生存率及GV期和GVBD期卵母細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)改變。

1.2.4 卵母細(xì)胞在不同濃度DMSO中的分組培養(yǎng)及觀察：取分離的卵母細(xì)胞，隨機(jī)分為30組，每組50個(gè)，在顯微鏡下將細(xì)胞隨機(jī)分入含0% （對(duì)照組）、1%和2% DMSO的M2培養(yǎng)微滴中 （每種濃度各10組） ，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h。顯微鏡下觀察每組卵母細(xì)胞生存率及GV期和GVBD期卵母細(xì)胞的數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基中小鼠卵母細(xì)胞的生存率

油封M2組卵母細(xì)胞的生存率 （98.65%±2%） 高于油封過夜M16液滴培養(yǎng)組 （90.35%±6%） ，M16直接培養(yǎng)存活率 （32.75%±14%） 極低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。見圖1。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)小鼠卵母細(xì)胞GV期和GVBD期數(shù)目的影響

油封M2組與油封M16組停留在GV期的卵母細(xì)胞數(shù) （油封M2組GV：16.10%±6%；油封M16組GV：14.40%±6%） 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） 。見圖2。

圖2 M2與M16培養(yǎng)4 h小鼠卵母細(xì)胞GV期與GVBD期數(shù)量比例Fig.2 Percentage of GV and GVBD of mouse oocytes cultured in M2 and M16 after 4 h

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖3所示，與油封過夜M16和單純M16液滴培養(yǎng)的卵母細(xì)胞相比，油封M2液滴培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)更好更完整。

2.4 不同濃度DMSO對(duì)培養(yǎng)的小鼠卵母細(xì)胞存活率的影響

對(duì)照組、1%DMSO組和2%DMSO組卵母細(xì)胞在雙線期阻滯期間的存活率 （對(duì)照組：98.50%±1.7%；1%DMSO組：97.54%±1.9%；2%DMSO組：99.00%±1.0%） 無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖4。

圖3 不同培養(yǎng)液對(duì)卵母細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect of different culture media on the morphology of oocytes

圖4 不同濃度DMSO對(duì)卵母細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Survival rate of oocytes in medium with different concentrations of DMSO

2.5 不同濃度DMSO對(duì)小鼠卵母細(xì)胞雙線期阻滯釋放的影響

對(duì)照組和1%DMSO組卵母細(xì)胞培養(yǎng)4 h后，卵母細(xì)胞停留在GV期和GVBD期的比例無明顯差異（P ＞ 0.05） ，2%DMSO組卵母細(xì)胞停留在GV期的比例顯著降低 （對(duì)照組：11.67%±4.58%；1%DMSO組：12.46%±5.84%；2%DMSO組：2.00%±2.83%，P ＜0.01）。表明DMSO濃度達(dá)2%時(shí)對(duì)卵母細(xì)胞雙線期阻滯釋放有促進(jìn)作用，而1%以下濃度的DMSO對(duì)卵母細(xì)胞雙線期阻滯釋放無顯著影響。見圖5。

3 討論

圖5 不同濃度DMSO培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞4h GV期與GVBD期數(shù)目比例Fig.5 Percentage of GV and GVBD of mouse oocytes cultured in medium with different concentrations of DMSO

卵母細(xì)胞的成熟對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖至關(guān)重要。然而，控制卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制一直眾說紛紜。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟與卵泡發(fā)育有關(guān)，同時(shí)細(xì)胞核包膜和染色體分離的調(diào)控是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和受精卵有絲分裂的重要事件［6-7］。卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的抑制因子能夠使卵母細(xì)胞被阻滯在第一次減數(shù)分裂前期 （前期Ⅰ） ，即GV期，也稱雙線期阻滯。當(dāng)卵母細(xì)胞從卵泡中釋放后，自發(fā)地恢復(fù)減數(shù)分裂［8-9］，即雙線期阻滯釋放，在第一次減數(shù)分裂之前，哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞從GV期發(fā)育到了GVBD期。GVBD是核分離的開始，是減數(shù)分裂過程中的第一個(gè)重要事件，也是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志。

本研究結(jié)果顯示，在從GV發(fā)育到GVBD期間，油封M2液滴培養(yǎng)的卵母細(xì)胞比油封過夜和單純M16液滴培養(yǎng)的卵母細(xì)胞生存率更高，細(xì)胞形態(tài)更佳。M2培養(yǎng)液中含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸［4- （2-hydroxyerhyl） piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES］，該成分能夠有效維持培養(yǎng)液pH值，有利于所有配子和胚胎的體外操作［5］。而M16培養(yǎng)液中則不含有HEPES成分，缺乏維持恒定pH值的能力，因此，需要在培養(yǎng)前4～6 h或1 d制作并覆蓋礦物質(zhì)油后放入培養(yǎng)箱內(nèi)平衡［5］。但本研究結(jié)果顯示，油封M16液滴培養(yǎng)的卵母細(xì)胞的形態(tài)及存活率仍不及油封M2組。提示利用油封M2液滴短時(shí)間培養(yǎng)卵母細(xì)胞，不僅能節(jié)省制備培養(yǎng)液的時(shí)間，而且更容易獲得滿意的卵母細(xì)胞狀態(tài)和生存率，有利于提高實(shí)驗(yàn)效率與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可信性。

在進(jìn)行藥物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要將藥物溶解后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，為了獲得準(zhǔn)確可信的結(jié)果，必須盡量減少溶媒本身對(duì)細(xì)胞的影響。DMSO是一種常用的藥物溶媒，研究發(fā)現(xiàn)，DMSO對(duì)某些癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性影響，不同種類的癌細(xì)胞對(duì)DMSO的耐受劑量亦不同［4，9］。本研究結(jié)果顯示，1%和2%濃度的DMSO不會(huì)影響培養(yǎng)卵母細(xì)胞的生存率，但是2%濃度的DMSO能更有效地促進(jìn)卵母細(xì)胞雙線期阻滯的釋放，因此，在進(jìn)行卵母細(xì)胞發(fā)展成熟進(jìn)程的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)合理控制DMSO的濃度，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信性。