武晉英，張洲，李子威，王昊然，操孫潤，李宇恒，宋曉宇，曹流

（中國醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，遼寧省協(xié)同創(chuàng)新中心，沈陽 110122）

SAMHD1 （sterile α motif domain and HD domaincontaining protein 1） 蛋白是真核細(xì)胞內(nèi)的一種天然免疫抑制因子［1-2］，HD蛋白結(jié)構(gòu)域具有脫氧核苷三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate， dNTP） 水解酶活性，可水解病毒RNA、DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的原料物質(zhì)，從而阻斷病毒侵襲宿主細(xì)胞、發(fā)揮抑制病毒感染的功能［3-8］。SAMHD1基因突變可誘發(fā)類似先天性病毒感染的遺傳性自身免疫性疾病、Aicardi-Goutières 綜合征 （Aicardi-Goutières syndrome，AGS）［9-10］。近期研究發(fā)現(xiàn)SAMHD1蛋白dNTP水解酶活性可被細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶磷酸化修飾調(diào)節(jié)［11］，進(jìn)而參與細(xì)胞周期調(diào)控、維系細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［12］、調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)進(jìn)程［13-14］，從而影響腫瘤等疾病的發(fā)生與治療［15-16］。為了深入研究SAMHD1蛋白的功能與相關(guān)分子機(jī)制，急需建立穩(wěn)定表達(dá)SAMHD1蛋白的細(xì)胞系。本研究利用慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體pCDH-EF1- MCS-T2A-copGFP，進(jìn)行穩(wěn)定過表達(dá)人源SAMHD1基因的結(jié)腸癌細(xì)胞系構(gòu)建，并進(jìn)行1型單純皰疹病毒 （herpes simplex virus type 1，HSV-1） 病毒感染實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，為進(jìn)一步探索SAMHD1的生物學(xué)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及主要試劑

pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒 （PCMV-dr8.9dvpr418 和 PCMV-VSV-G419）、人結(jié)腸癌細(xì)胞 （HCT116） 為本實(shí)驗(yàn)室保存；HSV-1購自遼寧佰昊生物科技有限公司；RNAiso PLus、M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA試劑盒、 PrimerSTAR、 EcoR1、 BamH1、T4 Ligase、E.coli.DH5a購自日本TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自美國Axygen公司；轉(zhuǎn)染試劑Tubofect transfection購自美國Thermo Scientific公司；Anti-SAMHD1、β-actin 抗體購自英國Abcam公司；其余分子生物學(xué)試劑購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116用含10%胎牛血清及青霉素 （100 U/mL） 和鏈霉素 （100 U/mL） 的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的生長情況進(jìn)行傳代，調(diào)整好細(xì)胞狀態(tài)備用。

1.3 總RNA的提取及cDNA合成

運(yùn)用Trizol法提取HCT116細(xì)胞中的總RNA，在ThermoNanodrop濃度分析儀上測定總RNA濃度，然后利用cDNA合成試劑盒，逆轉(zhuǎn)綠合成cDNA，將其暫存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)GENBANK中的人源SAMHD1基因序列，設(shè)計(jì)SAMHD1引物：F，CCGGAATTCATGCAGCGAGC CGATTC； R，CGGGATCCTCACATTGGGTCATCT。以1.3中合成的cDNA為模板擴(kuò)增SAMHD1全長編碼區(qū)序列。純化PCR產(chǎn)物，并將其與pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，最后利用T4 Ligase將SAMHD1片段與pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切初步鑒定，送測序驗(yàn)證。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)人源SAMHD1細(xì)胞株構(gòu)建

1.5.1 表達(dá)人源SAMHD1的慢病毒制備：分別將4.4 μ g PCMV-dr8.9dvpr418、2.2 μ g PCMV-VSV-G419、3.4 μ g pCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP或pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP 質(zhì)粒稀釋于1 mL無血清DMEM，加入20 μ L Tubofect轉(zhuǎn)染試劑，立即混勻并低速離心，室溫放置15～20 min，將上述混合液加入準(zhǔn)備好的293T細(xì)胞，6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，24、48、72 h分別收集上清，2 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片，上清即為含有 pCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP或pCDHEF1-MCS-T2A-copGFP 的病毒液。收集上清并加入適量PEG-it于4 ℃混轉(zhuǎn)過夜，4 000 r/min離心30 min，500 μ L PBS重懸沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 穩(wěn)定表達(dá)人源SAMHD1細(xì)胞株建立：用1.5.1中制備的病毒 （100 μ L） 感染細(xì)胞 （培養(yǎng)皿直徑=35 mm） ，密度約40% （1×105/皿） 的HCT116細(xì)胞，24 h后重復(fù)感染，48 h后正常培養(yǎng)。

1.5.3 穩(wěn)定表達(dá)人源SAMHD1細(xì)胞株鑒定：冰上制備穩(wěn)定表達(dá)SAMHD1的116細(xì)胞總蛋白樣。Western blotting檢測目的蛋白表達(dá)。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)SAMHD1細(xì)胞株的抗HSV-1病毒作用檢測

首先進(jìn)行HSV-1病毒擴(kuò)大培養(yǎng)，用10 cm直徑培養(yǎng)皿培養(yǎng)Hela細(xì)胞，密度達(dá)到100% （約1×107/皿） 后更換培液，加入新鮮培養(yǎng)基9 mL，再加入1 mL HSV-1病毒液。48～72 h收取上清，1 000 r/min離心 5 min，取上清，4 ℃冰箱短期保存。然后培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，密度50%～70% （約7×106/皿） 時(shí)感染病毒 （培養(yǎng)基∶病毒液=9∶1） ，病毒感染12 h后換液。HSV-1病毒用綠色熒光蛋白 （green fluorescent protein，GFP） 標(biāo)記。在熒光顯微鏡下觀察并記錄HSV-1感染0、12、24、36、48 h后情況，收集感染后細(xì)胞進(jìn)行蛋白印記實(shí)驗(yàn)，檢測病毒感染的標(biāo)志性蛋白 （HSV-GD） 來評價(jià)過表達(dá)細(xì)胞株的抗病毒作用。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

結(jié)果顯示，以合成的cDNA為模板采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，把PCR產(chǎn)物連接到慢病毒表達(dá)載體pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pCDH-EF1-MCS-SAMHD1- T2A-GFP。將重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，片段大小約為1 800 bp，與SAMHD1片段長度相符，見圖 1。DNA測序結(jié)果證明SAMHD1基因插入方向及讀碼框正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)SAMHD1的細(xì)胞株建立及鑒定

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Restriction enzyme digestion results of the recombinant plasmid identified by agarose gel electrophoresis

圖2 重組質(zhì)粒測序結(jié)果圖Fig.2 Sequencing chromatogram of the recombinant plasmid

將pCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP和pCDHEF1-MCS-T2A-copGFP的假病毒感染HCT116細(xì)胞，感染2次后更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞裂解液裂解感染后的細(xì)胞。Western blotting檢測結(jié)果顯示，感染pCDH-EF1-MCS- SAMHD1-T2A-GFP病毒細(xì)胞在72×103位置條帶亮度明顯增強(qiáng)，SAMHD1蛋白的相對表達(dá)量為1.108±0.066； 而空白對照HCT116細(xì)胞和感染pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP病毒液細(xì)胞在72×103位置未見條帶亮度明顯改變，SAMHD1蛋白相對表達(dá)量分別為0.708±0.043和0.719±0.011，見圖3。表明穩(wěn)定過表達(dá)SAMHD1的HCT116細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.3 穩(wěn)定表達(dá) SAMHD1 細(xì)胞株抗病毒功能評價(jià)

圖3 Western blotting 檢測HCT116細(xì)胞中SAMHD1 蛋白表達(dá)Fig.3 Western blotting results of SAMHD1 protein expression in HCT116 cells

利用HSV-1 GFP病毒對目的細(xì)胞進(jìn)行0、12、24、36、48 h感染，觀察目的細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)度的高低變化確定感染時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36 h病毒感染效率最高。pCDH+HSV-1與未感染病毒pCDH組比較，感染組GFP熒光亮度明顯增高，說明感染成功。但是同樣都進(jìn)行病毒感染的pCDH+ SAMHD1+ HSV-1組與pCDH+ HSV-1組細(xì)胞比較，GFP熒光亮度卻未見明顯增高，見圖4A。結(jié)果顯示，與pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的HCT116細(xì)胞 （相對表達(dá)量為11.509±0.607 ）比較，穩(wěn)定表達(dá)pCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP細(xì)胞 （相對表達(dá)量為1.234±0.072 ） GFP表達(dá)明顯較少。同時(shí)收集感染后細(xì)胞進(jìn)行蛋白印記實(shí)驗(yàn)，檢測病毒感染的標(biāo)志性蛋白 （HSV-GD） 表達(dá)來評價(jià)過表達(dá)細(xì)胞株的抗病毒作用。蛋白印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明過表達(dá)SAMHD1細(xì)胞中病毒感染的標(biāo)志性蛋白HSV-GD表達(dá)較低，見圖4B。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)SAMHD1基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株能夠有效抑制HSV-1復(fù)制。

3 討論

2011年，研究［17］證實(shí)SAMHD1是一種有效的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）限制因子。作為目前發(fā)現(xiàn)唯一的dNTP水解酶，SAMHD1通過調(diào)控脫氧核糖核苷三磷酸的含量來限制非循環(huán)細(xì)胞中的HIV-1感染，并且能夠阻斷細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)錄過程和DNA病毒的復(fù)制［5-6，18］。隨后人們對其抗病毒功能進(jìn)行了大量研究，dNTP是細(xì)胞、寄生蟲和病毒DNA聚合酶的通用底物［19］，因此細(xì)胞dNTP含量幾乎影響所有dsDNA病毒的基因組復(fù)制，目前認(rèn)為SAMHD1維系核苷酸含量的動(dòng)態(tài)平衡可能是細(xì)胞限制各種病毒復(fù)制的一般機(jī)制。

圖4 過表達(dá) SAMHD1 細(xì)胞系的抗病毒功能評價(jià)Fig.4 Evaluation of the antiviral function of the cell line overexpressing SAMHD1 gene

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染存在表達(dá)效率不一致且外源基因表達(dá)會(huì)隨細(xì)胞生長繁殖而逐漸降低，無法傳到子代，臨床研究［20］證明單純皰疹病毒 （herpes simplex virus，HSV） 是人類最常見的病原體，人是唯一的自然宿主，本研究選擇人結(jié)腸癌細(xì)胞作為工具細(xì)胞，通過瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)及測序結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。利用慢病毒包裝系統(tǒng)建立SAMHD1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，Western blotting檢測結(jié)果表明穩(wěn)定過表達(dá)SAMHD1的細(xì)胞株構(gòu)建成功。免疫熒光和Western blotting結(jié)果證明穩(wěn)定過表達(dá)SAMHD1可以有效抑制HSV-1在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的復(fù)制，且證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的穩(wěn)定過表達(dá)SAMHD1細(xì)胞株具有SAMHD1的生物學(xué)功能。

SAMHD1具有廣泛的抗病毒功能，能夠有效抑制DNA病毒HSV-1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的復(fù)制。但是SAMHD1是否對其他類型病毒及在其他細(xì)胞中有同樣的生物學(xué)功能，還需進(jìn)一步探討。本研究為深入研究SAMHD1蛋白的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)保障。