樊璐，王慧，肖慶桓

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院離子通道藥理學(xué)研究室，沈陽 110122）

跨膜蛋白16F （transmembrane protein16F，TMEM16F）又稱作Anoctamin （ANO） 6，是TMEM16家族的成員之一［1］，是1個具有10次跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白。它在人類許多組織 （胃上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板細(xì)胞、脈管系統(tǒng)以及腎臟） 中都有表達(dá)［2］，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

TMEM16F結(jié)構(gòu)還不明確，目前主要有3種說法：（1） TMEM16F具有磷脂翻轉(zhuǎn)功能，這與其他TMEM16家族成員不同［3-4］，在細(xì)胞膜上存在磷脂分布不對稱性，外小葉上富含鞘磷脂和磷脂酰膽堿，內(nèi)部小葉上含有磷酯酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，這種磷脂不對稱分布由一種依賴ATP的蛋白 （scramblease）維持。無論在生理還是病理?xiàng)l件下Ca2+依賴的scramblease激活通過催化使磷酯酰絲氨酸快速外翻到細(xì)胞表面，而使這種膜不對稱性崩塌［5］。 （2） 研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，TMEM16F作為一種Ca2+激活的非選擇性陽離子通道在血凝固期間能夠?qū)ρ“逶斐闪字D(zhuǎn)。 （3） 有研究［8］認(rèn)為TMEM16F是Ca2+激活的陰離子通道。

2009年，研究［9］發(fā)現(xiàn)TMEM16家族中的很多成員都在腫瘤中過表達(dá)。研究［10］也發(fā)現(xiàn)TMEM16家族中的TMEM16A、TMEM16F、TMEM16K通常在同一組織中表達(dá)，并且TMEM16A基因定位于人類染色體11q13區(qū)域 （amplicon core） ，此區(qū)域很多基因在乳腺癌、肺癌中高表達(dá)，且在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中都有重要作用［11］。2013年，有研究［12］表明在TMEM16F和TMEM16A穩(wěn)定敲除的ELA細(xì)胞中，細(xì)胞遷移速率下降，并且TMEM16F會促進(jìn)成肌細(xì)胞C2C12增殖［13-14］。TMEM16F與TMEM16A同源，TMEM16F與乳腺癌的相關(guān)性及對乳腺癌細(xì)胞遷移和增殖的影響還需進(jìn)一步研究。本研究擬探討TMEM16F在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，瞬時轉(zhuǎn)染靶向TMEM16F的特異性shRNA到乳腺癌細(xì)胞T47D中，檢測TMEM16F對乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌MDA-MB-231、T47D細(xì)胞 （均來自美國菌種保藏中心） 于5%CO2、37 ℃的恒溫箱內(nèi)，在含10%胎牛血清 （以色列Biological Industries公司） 和1%青霉素和鏈霉素的DMEM胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)染

鼠源TMEM16F的small hairpin RNA （shRNA，上海吉凱基因公司） ，序列為ATGTACTCACGTAGTGA TA，用scrambled shRNA （TTCTCCGAACGTGTCACGT）作為陰性對照。采用Lipofectamin 2000 （美國Invitrogen公司） 在無血清的培養(yǎng)基中瞬時轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞的靶向TMEM16F特異性shRNA。轉(zhuǎn)染48 h后將細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western blotting檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后將T47D細(xì)胞在含有RIPA緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物 （中國Beyotime公司） 的冰冷裂解緩沖液中勻漿。在含有蛋白酶抑制劑和PMSF （細(xì)胞裂解緩沖液試劑盒，中國Beyotime Biotechnology公司） 的冰冷RIPA緩沖液中，將細(xì)胞裂解物以13 400 r/min離心15 min，使用BCA方法測定蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，通過濕轉(zhuǎn)膜方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉封閉，然后用TMEM16F抗體 （1∶1 000，美國Thermo公司） 4 ℃下過夜孵育。用β-actin作為內(nèi)參對照，然后將PVDF膜用與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔二抗 （1∶10 000，美國Abcam公司） 室溫下孵育1 h。使用顯色增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測液ECL （美國BIO-RAD公司） 進(jìn)行顯影 。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

通過CCK-8試劑盒 （中國Biosharp公司） 檢測細(xì)胞活力。將轉(zhuǎn)染48 h后的T47D細(xì)胞 （2×103/孔） 接種到96孔板中。細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長24 h后與CCK-8溶液一起溫育2 h。采用酶標(biāo)儀 （美國Molecular Devices公司） 450 nm波長測量。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后將細(xì)胞 （1×106/孔） 接種在6孔板中。用200 μ L移液管尖端輕輕刮擦匯合細(xì)胞，然后PBS輕輕洗滌。使用光學(xué)顯微鏡在0、24 h分別獲得圖像，并記錄劃痕面積。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 62.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，2組比較采用t檢驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞中TMEM16F蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，TMEM16F在乳腺癌細(xì)胞T47D及MDAMB-231中均有表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞T47D表達(dá)水平高于乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231?？梢奣MEM16F與乳腺癌密切相關(guān)，見圖1。

2.2 2組乳腺癌細(xì)胞T47D中TMEM16F蛋白表達(dá)比較

相對于轉(zhuǎn)染TMEM16F scrambled shRNA組（1.00±0.00） ，靶向TMEM16F的特異性shRNA組 （0.42±0.12）對TMEM16F表達(dá)有明顯抑制作用，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （t = 6.072，P = 0.026 1） 。

圖2 2組乳腺癌細(xì)胞T47D 中TMEM16F蛋白表達(dá)比較Fig.2 Western blotting reveals TMEM16F protein expression in T47D cells from both specific shRNA group and the control group

2.3 敲除T47D乳腺癌細(xì)胞TMEM16F后對細(xì)胞增殖能力的影響

結(jié)果顯示，特異性靶向TMEM16F的shRNA體外轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞T47D，敲除TMEM16F后T47D細(xì)胞增殖能力減弱。與對照組 （scrambled shRNA組，1.00±0.00） 比較，敲除T47D細(xì)胞中TMEM16F后細(xì)胞增殖（0.50±0.14） 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （t = 5.055，P = 0.037 0） 。

2.4 敲除T47D乳腺癌細(xì)胞TMEM16F后對細(xì)胞遷移能力的影響

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TMEM16F shRNA后，T47D細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，見圖3。與對照組［scrambled shRNA組， （31.45±0.94） %］比較，敲除T47D細(xì)胞中TMEM16F后的細(xì)胞遷移率［ （46.74±0.42） %］增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （t = 19.17，P = 0.002 7） 。

3 討論

圖3 敲除T47D乳腺癌細(xì)胞TMEM16F后對細(xì)胞遷移能力的影響×4Fig.3 Migration ability upon TMEM16F knockdown in T47D breast cancer cells×4

研究［1］表明TMEM16家族參與多種生理功能 （離子運(yùn)輸、磷脂翻轉(zhuǎn)以及其他膜蛋白監(jiān)管等） 。YU等［10］發(fā)現(xiàn)TMEM16家族中TMEM16F與TMEM16A密不可分，TMEM16F具有scramblease活性，而 TMEM16A 沒有。并且通過TMEM16A與TMEM16F結(jié)合的雜交蛋白確定了TMEM16F區(qū)域負(fù)責(zé)scramblease活性。除此之外，scramblease區(qū)域電腦模型顯示出它能夠向細(xì)胞膜表面形成1個凹槽來幫助磷脂穿梭于細(xì)胞膜的雙分子層，最終這個凹槽能夠與其他的蛋白相互作用來調(diào)節(jié)磷脂翻轉(zhuǎn)［10］。2013年研究［12］發(fā)現(xiàn)ELA細(xì)胞中穩(wěn)定敲除TMEM16F和TMEM16A后細(xì)胞的遷移速率下降。但是TMEM16A和TMEM16F在細(xì)胞遷移過程中扮演不同角色，進(jìn)而影響細(xì)胞遷移機(jī)制中的不同組分，TMEM16A更傾向于轉(zhuǎn)向過程，TMEM16F更類似于遷移過程中的“引擎”，影響遷移速率［12］。研究［13-15］表明TMEM16A能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，TME-M16A在乳腺癌細(xì)胞中能夠通過ERK/AKT信號通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。2014年ZHAO等［16］研究發(fā)現(xiàn)TMEM16F也可以通過ERK/AKT通路相似地調(diào)節(jié)C2C12細(xì)胞，促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果證實(shí)，無論是三陰性乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231） ，還是PR、ER陽性乳腺癌細(xì)胞 （T47D）中，TMEM16F均表達(dá)，說明乳腺癌細(xì)胞與TMEM16F相關(guān)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMEM16F敲除后T47D細(xì)胞生存能力降低，證實(shí)TMEM16F可能促進(jìn)T47D乳腺癌細(xì)胞增殖。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TMEM16F敲除后的T47D細(xì)胞遷移率增加，證實(shí)TMEM16F可能會抑制T47D乳腺癌細(xì)胞的遷移。

綜上所述，TMEM16F在T47D乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲除TMEM16F能夠抑制T47D乳腺癌細(xì)胞增殖而促進(jìn)T47D乳腺癌細(xì)胞遷移。但TMEM16F在乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移過程中具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。乳腺癌患者治療通常采用全身、局部或者綜合治療［17］。雖然通過活檢或者常規(guī)影像學(xué)和放射學(xué)檢查可以獲得相應(yīng)的疾病進(jìn)展?fàn)顩r，但在沒有相應(yīng)標(biāo)志物的情況下可能導(dǎo)致治療無效，因此尋找到新的靶向標(biāo)志物至關(guān)重要。本研究提示TMEM16F可能成為乳腺癌細(xì)胞治療的新的靶向標(biāo)志物。