李木子，陳克研，孫倩，邱雨華

（1. 遼寧省金秋醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 110016； 2. 中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，沈陽 110122）

急性腎損傷 （acute kidney injury，AKI） 是臨床上多種原因?qū)е碌奈＜敝匕Y，19%～31%的患者因為腎功能不能完全恢復(fù)導(dǎo)致腎衰竭，死亡率高［1］。 膿毒血癥是AKI最常見的原因［2］。研究［3-4］表明，膿毒血癥誘導(dǎo)的AKI致病機制與其他病因引發(fā)的AKI不同。在膿毒血癥人群中，不依賴于AKI的嚴重程度，存在3種病理學(xué)改變：微循環(huán)功能障礙、炎癥和對損傷的生物能適應(yīng)性反應(yīng)［5-7］。細胞表面TLR4識別內(nèi)毒素及其下游反應(yīng)在脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 導(dǎo)致的AKI病理生理中起著重要作用［8］。沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯 （epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶提取物的主要兒茶素，是強效的抗氧化劑和活性氧清除劑［9］。研究［10］表明，EGCG在AKI模型中具有潛在的作用。然而，EGCG對AKI的影響和分子生物機制尚未闡明，故本研究擬通過建立LPS誘導(dǎo)大鼠AKI模型，探討EGCG對AKI大鼠的保護作用及分子生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：TLR4、Myd88、核因子kappa B （nuclear factor-kappa B，NF-κ B）抗體 （美國CST公司）；LPS來源于大腸桿菌O55；BS （英國Sigma-Aldrich公司）；白細胞介素-6 （interleukin 6，IL-6） 、白細胞介素-1 β（interleukin 1 β，IL-1 β） 、白細胞介素-10 （interleukin 10，IL-10） 和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-alpha，TNF-α） ELISA試劑盒 （武漢USCN公司）；EGCG （中國阿拉丁試劑有限公司） 。

1.1.2 實驗動物分組及模型制備：清潔級SD大鼠，雄性，40只，體質(zhì)量200～220 g，購自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物科，在屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。動物實驗經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會批準。SD大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組 （Sham組） 、LPS誘導(dǎo)急性腎損傷組 （AKI組） 、EGCG治療組 （EGCG組）和EGCG+LPS+TLR4抑制劑組 （TLR4組） ，每組10只。AKI組、EGCG組、TLR4組大鼠采用腹腔注射LPS （40 mg/kg） 建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型；EGCG組在建模前4 d每天灌胃EGCG （80 mg/kg） ，TLR4組在給予EGCG后腹腔注射TLR4抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與檢測：各組大鼠于模型建立后6 h處死，取血液分離血清，一部分送檢驗科檢測尿素氮 （urea nitrogen，BUN）和血清肌酐 （serum creatinine，Cr） 含量，另一部分用于ELISA檢測，剩余部分用于鱟試劑合成基質(zhì)偶氮顯色法 （試劑盒購于廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）；取腎臟組織，一部分置于多聚甲醛中，另一部分低溫冰箱保存。

1.2.2 ELISA檢測血清中炎性細胞因子含量

按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6、IL-1 β、TNF-α和IL-10含量變化。依次倍比稀釋標準品建立標準曲線，加入待測樣本37 ℃孵育90 min，PBST洗滌；加入50 μ L酶標二抗，37 ℃孵育30 min；每孔加入顯色劑50 μ L，避光顯色15 min，每孔加入終止液50 μ L；酶標儀檢測，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.2.3 HE染色檢測腎臟組織：組織進行脫水、透明、浸蠟后對心肌組織進行石蠟包埋，將包埋好的腎臟組織進行連續(xù)切片后，將切片脫蠟至水，蘇木素染色2～3 min后，鹽酸乙醇分化3～5 s，伊紅染色1 min，切片梯度脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察腎臟組織的病理學(xué)變化。

1.2.4 實時PCR檢測：將收集的腎臟組織加入Trizol（美國Invitrogen公司，15596026） 溶液中，按照Trizol試劑操作說明書進行分離提取組織和細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA （美國Thermo公司，K1622） 后，按照實時PCR （美國Qiagen公司，204057）法檢測TLR4、Myd88和NF-κ B，參照試劑盒說明書操作，引物由上海杰瑞生物公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次； 融解曲線分析95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。結(jié)果采用2-ΔΔCt計算。

表1 實時PCR引物Tab.1 Gene-specific primers used for qRT-PCR

1.2.5 Western blotting檢測：將腎臟組織置于含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，于冰上對心肌組織進行勻漿，收集上清液后，使用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，蛋白上樣行SDS-PAGE電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜后，加入TLR4、Myd88和NF-κ B抗體 （1∶1 000） ，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h后，使用ECL發(fā)光試劑盒和凝膠成像系統(tǒng)對蛋白進行顯色，結(jié)果使用Image J軟件進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素檢測

與Sham組LPS含量 （0.016±0.003） 相比，AKI組LPS含量 （0.372±0.015） 顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；與AKI組相比，EGCG組LPS含量 （0.132±0.012） 顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；與EGCG組相比，TLR4組LPS含量 （0.318±0.009） 顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。

2.2 病理組織學(xué)變化

與Sham組相比，AKI組腎臟腎小管擴張、出現(xiàn)腎小球炎癥反應(yīng)；與AKI組相比，EGCG組可明顯減輕腎臟損傷，腎小球炎癥減輕；加入TLR4抑制劑后，EGCG的作用減弱。見圖1。

圖1 HE染色檢測各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化 ×200Fig.1 Pathological changes in kidney tissues of rats from each group by HE staining ×200

2.3 腎功能檢測

與Sham組Cr （40.21±6.34）和BUN （6.07±0.71） 含量相比，AKI組Cr （130.34±11.23）和BUN （28.41±2.21）含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；與AKI組相比，EGCG組Cr （80.29±9.87）和BUN （19.22±2.31）含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；與EGCG組相比，TLR4組Cr （119.84±8.96）和BUN （23.27±1.71） 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。

2.4 炎性細胞因子檢測

與Sham組IL-6 （8.764±0.821） 、 IL-1 β （43.227±8.227） 、TNF-α （57.281±3.882） 和IL -10 （164.32±10.88） 水平相比，AKI組IL-6 （15.283±1.241） 、IL-1 β （262.273±26.942） 和TNF-α （195.517±11.423） 水平顯著升高，IL -10 （101.53±9.74） 水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）；與AKI組相比，EGCG組IL-6 （10.642±0.912） 、IL-1 β （137.731±9.811） 和TNF-α （103.732±4.713） 水平顯著降低，IL -10 （184.33±8.93） 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；與EGCG組相比，TLR4組逆轉(zhuǎn)了EGCG的抑制炎癥反應(yīng)作用，IL-6 （13.281±1.428） 、IL-1 β （198.732±18.742） 和TNF-α （136.832±9.883） 水平顯著升高，IL -10 （133.42±9.92） 水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。

2.5 腎臟組織中TLR4、Myd88和NF-κ B蛋白和mRNA表達水平

分別用實時PCR和Western blotting檢測TLR4、Myd88、NF-κ B蛋 白 和mRNA表 達，與Sham組TLR4、Myd88和NF-κ B蛋白 （0.39±0.048、0.31±0.035、0.71±0.063） 和mRNA （1±0、1±0、1±0） 表達相比，AKI組TLR4、Myd88和NF-κ B蛋白 （1.19±0.088、0.74±0.053、1.33±0.092） 和mRNA （1.832±0.084、1.721±0.056、1.984±0.093） 表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜0.05）；與AKI組 相 比，EGCG組TLR4、Myd88、NF-κ B蛋白 （0.98±0.039、0.57±0.042、1.04±0.048） 和mRNA（1.432±0.071、1.503±0.072、1.573±0.066） 表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；與EGCG組相比，TLR4組TLR4、 Myd88、 NF-κ B蛋白 （0.68±0.055、0.42±0.038、 0.81±0.053） 和 mRNA （1.215±0.051、1.098±0.048、1.224±0.084） 表達顯著降低 （P ＜ 0.05） 。見圖2。

圖2 Western blotting法檢測腎臟組織中TLR4、Myd88和NF-κ B蛋白表達水平結(jié)果Fig.2 Western blotting results for the expression of TLR4，Myd88，and NF-κ B in rat kidney tissues.

3 討論

本研究利用LPS構(gòu)建了內(nèi)毒素AKI模型，LPS誘導(dǎo)的AKI主要病理生理學(xué)特征為內(nèi)皮功能障礙，腎小球內(nèi)血栓形成和腎小管損傷的腎實質(zhì)中的嚴重炎癥反應(yīng)。研究［11］表明LPS誘導(dǎo)的大鼠AKI，可以引起大鼠腎臟組織IL-6、TNF-α和IL-1 β等炎性細胞因子表達的上調(diào)，因此，抑制這些炎性細胞因子的表達可以預(yù)防LPS誘導(dǎo)的AKI。

EGCG作為強效的抗氧化劑和活性氧清除劑，已證實有強抗炎作用［12］。CHANG等［13］研究發(fā)現(xiàn)，用環(huán)孢菌素 （cyclosporine A，CsA） 誘導(dǎo)的腎毒性大鼠模型中，EGCG對由氧自由基引起的腎功能改變具有保護作用。EL-MOWAFY等［14］研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過抑制白細胞增多、全身炎癥、氧化應(yīng)激來避免CP引起大鼠腎臟損傷。本研究結(jié)果顯示，EGCG預(yù)處理LPS引起的AKI，BUN和Cr的表達水平明顯下降，表明EGCG對大鼠腎臟具有明顯的保護作用。ELISA檢測結(jié)果表明，血清中IL-6、TNF-α和IL-1 β的表達也明顯下降。這些結(jié)果表明EGCG對LPS誘導(dǎo)AKI大鼠的腎臟保護是通過抑制腎臟組織中的炎性細胞因子來實現(xiàn)的。

TOLL樣受體作為一種參與全身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的重要識別受體，能介導(dǎo)免疫細胞識別病原微生物，并引發(fā)全身免疫反應(yīng)［15］。研究［16］表明，TLR4在LPS誘導(dǎo)的AKI動物模型中表達顯著增高，LPS誘導(dǎo)后TLR4水平的增加可能與炎性細胞因子介導(dǎo)的受體表達增加有關(guān)。本研究進一步探討了EGCG調(diào)控內(nèi)毒素血癥大鼠腎臟炎癥反應(yīng)的作用機制，結(jié)果顯示，EGCG能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4的表達及下游因子Myd88和NF-κ B的活化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，EGCG可以明顯減輕LPS導(dǎo)致的大鼠腎損傷和全身炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與TLR4/Myd88/NF-κ B通路有關(guān)。