饒遠(yuǎn)

木芙蓉屬錦葵科木槿屬小喬木，在我國(guó)南方很常見，其花大、色艷，觀賞價(jià)值高。《本草綱目》言其“治一切大小癰疽，腫毒惡瘡，消腫，排膿，止痛”。我查閱CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，研究木芙蓉抑菌作用的文獻(xiàn)很少，只發(fā)現(xiàn)李昌靈老師對(duì)木芙蓉葉提取物的抑菌作用進(jìn)行過研究。研究木芙蓉花抑菌效果的文獻(xiàn)則沒有。

金黃色葡萄球菌是化膿感染中最常見的病原菌，可引起青春痘的化膿感染。受李昌靈老師的研究啟發(fā)，我進(jìn)行了木芙蓉花70% 乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的探究。

一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器

木芙蓉花，乙醇（國(guó)產(chǎn)分析純），金黃色葡萄球菌，LB 固體培養(yǎng)基，LB 液體培養(yǎng)基。

立式壓力蒸汽滅菌器，搖床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，水平層流凈化工作臺(tái)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA），JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。

二、實(shí)驗(yàn)過程

1.制備木芙蓉花70%乙醇提取液

將新鮮的木芙蓉花用水洗凈，烘干、粉碎，取20g木芙蓉花干粉，加入200mL70%乙醇，進(jìn)行超聲波細(xì)胞粉碎，使所得濾液溫度保持在65℃，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，用容量瓶定容至濃度為1g/mL。滅菌20min后，放入冰箱，在4℃的環(huán)境下冷藏。

2.制備菌懸液

在無菌條件下，將37℃活化后的金黃色葡萄球菌取出，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄖ苽?08cfu/mL菌懸液，再稀釋為106cuf/mL的菌懸液。

3.瓊脂打孔法

在無菌條件下，取106cfu/mL的金黃色葡萄球菌懸液100uL，涂布于LB固體培養(yǎng)基，用滅菌的50uL的移液槍槍頭在滅菌的LB 固體培養(yǎng)基上打孔，并挑出孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿打4個(gè)孔。其中3個(gè)孔注入滅菌的1g/mL木芙蓉花70%乙醇提取液，另一個(gè)孔注入1%鏈霉素作為陰性對(duì)照。

同時(shí)，4個(gè)孔液面上放入滅菌的打孔濾紙圓片，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，重復(fù)3次，測(cè)定抑菌圈半徑（為孔邊緣至相對(duì)應(yīng)的透明圈的最外緣間的環(huán)形距離）。

4.二倍稀釋法

在無菌條件下，取8支試管，分別注入1mL的LB液體培養(yǎng)基，采用二倍稀釋法，將濃度為1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液分別稀釋，得到濃度為1g/mL，0.5g/mL，0.25g/mL，

0.125g/mL，0.0 625g/mL，0.03 125g/mL的藥液，編號(hào)1～6，每支試管都含有 1mL的不同稀釋度藥液。取剩余的2支試管中的1支加入0.03mL1% 鏈霉素作陰性對(duì)照，另1支不加，作陽(yáng)性對(duì)照。

在上述8支試管中各接種100uL 106cfu/mL金黃色葡萄球菌懸液，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長(zhǎng)情況。

三、結(jié)果與分析

1.瓊脂打孔法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)瓊脂打孔法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌透明圈。

1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)孔注入的是1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液，淺棕色表明木芙蓉花提取液滲透至固體培養(yǎng)基中，淺棕色區(qū)域因提取液漸次滲透，所以有菌長(zhǎng)出。孔邊緣的深棕色為抑菌透明圈，透明圈區(qū)域無菌落長(zhǎng)出，其最大抑菌圈半徑是10mm，最小抑菌圈1mm，眾數(shù)是3mm。

4號(hào)孔注入的是1%鏈霉素，孔四周透明，無菌長(zhǎng)出，表明鏈霉素有較強(qiáng)的抑菌效果，如圖 1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1g/mL的木芙蓉花70% 乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。

2.二倍稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

瓊脂打孔法的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1g/mL的木芙蓉花70%乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。在此基礎(chǔ)上采用二倍稀釋法進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步了解其最低抑菌濃度（MIC），實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象見圖2。

培養(yǎng)24h后，振蕩1號(hào)至5號(hào)試管培養(yǎng)液后無混濁現(xiàn)象，說明無菌長(zhǎng)出。振蕩6號(hào)試管后輕微混濁，說明有菌長(zhǎng)出。陽(yáng)性對(duì)照試管菌液明顯混濁，陰性對(duì)照試管中加入的是1% 鏈霉素，振蕩培養(yǎng)液后仍澄清，說明無菌長(zhǎng)出。

初步判斷，木芙蓉花70%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）為0.0 625g/mL。再將5號(hào)試管培養(yǎng)物取100uL涂布于固體LB培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后，平板上無菌落出現(xiàn)。

綜上結(jié)果可確定，木芙蓉花70%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）為0.0 625g/mL。詳細(xì)結(jié)果如表 1所示。

四、實(shí)驗(yàn)討論

李昌靈老師對(duì)木芙蓉葉提取物的抑菌作用進(jìn)行過研究，其數(shù)據(jù)表明，木芙蓉葉70%乙醇提取物抑制金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）為0.5g/mL。本實(shí)驗(yàn)參照李昌靈老師實(shí)驗(yàn)中定性研究的方法，得到木芙蓉花70%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）為0.0 625g/mL。

瓊脂打孔法操作簡(jiǎn)便，可作為篩選抑菌效果的定性方法。實(shí)驗(yàn)過程中考慮到培養(yǎng)過程中藥液會(huì)蒸發(fā)，所以蓋上紙片，既可減緩液體的蒸發(fā)，又可減少液體流入固體培養(yǎng)基底部。

二倍稀釋法是一種精確定量的方法，但操作復(fù)雜。另外，實(shí)驗(yàn)提取所得的藥液為顏色較深的中草藥制劑，若直接根據(jù)培養(yǎng)液的混濁度來判斷最低抑菌濃度（MIC），可能會(huì)因?yàn)轭伾疃鴮?dǎo)致觀察不準(zhǔn)確。在這之后將含最低濃度提取液的澄清液體培養(yǎng)基用涂平板的方法繼續(xù)培養(yǎng)24h，根據(jù)最終是否有菌落長(zhǎng)出則能較好地避免這種現(xiàn)象，確定最低抑菌濃度（MIC）。

本文利用木芙蓉花70%乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，為研究木芙蓉花的解毒、消腫、排毒功效提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但還未對(duì)其他常見病原菌的抑菌效果進(jìn)行研究，今后可進(jìn)一步探究。