顏思陽，陳 瑤，周德生，郭 純，劉利娟※

(1.湖南中醫(yī)藥大學研究生院，長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院a.神經(jīng)內(nèi)科，b.中心實驗室，長沙 410007)

腦卒中已成為世界上致死和致殘的第二大原因[1-2]，其以突然發(fā)病的神經(jīng)功能缺損為特征。而缺血性腦卒中約占全部卒中的69.6%，占腦卒中發(fā)病率的第一位，也是腦卒中死亡的首要原因[3]。據(jù)統(tǒng)計，缺血性腦卒中的發(fā)病率為91.3/10萬～263.1/10萬，年平均發(fā)病率為145.5/10萬，復發(fā)率為8.47%[4]。目前，急性腦梗死的治療[5]包括靜脈內(nèi)使用重組組織型纖溶酶原激活劑、血管內(nèi)機械取栓等，其治療目標均為使缺血的腦組織恢復血液供應，臨床亦稱之為再灌注。然而，雖然缺血腦組織氧氣供應的恢復有一定益處，但快速再灌注對腦功能可產(chǎn)生有害作用，即再灌注損傷。因此，腦梗死的理想治療策略是恢復缺血組織的氧氣供應，同時盡量減少再灌注損傷。作為缺血后神經(jīng)細胞死亡的關鍵靶區(qū)，線粒體與腦缺血再灌注損傷關系密切，其功能紊亂是腦缺血再灌注中細胞損傷的關鍵。腦缺血損傷中受損的線粒體可通過自噬活動被選擇性清除[6]。但研究證實，線粒體自噬是一把雙刃劍，即適當?shù)木€粒體自噬有助于保護神經(jīng)細胞，而線粒體自噬失調(diào)或過度可能是有害的[7]?，F(xiàn)就線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中的研究進展予以綜述。

1 線粒體自噬

線粒體是細胞內(nèi)的關鍵細胞器，被譽為細胞的動力工廠。除能為細胞提供能量外，其還參與了多種重要細胞活動。Lemasters[8]于2005年首次提出線粒體自噬這一概念，其指細胞為維持正常生理過程，進化產(chǎn)生的一種利用自噬活動選擇性清除損傷線粒體的機制，這一機制可能具有減少由衰老引起的線粒體DNA突變的作用。線粒體自噬可以控制線粒體的數(shù)量使之與新陳代謝的需求相匹配，同時也是一種對受損線粒體的清除和控制手段。

1.1線粒體自噬相關蛋白 研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注過程中線粒體自噬受多種蛋白的調(diào)節(jié)，包括第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物誘導的假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)、Parkin、Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B-19 kDa-interacting protein 3,BNIP3)等[9-11]。而在哺乳動物細胞中，存在兩種與線粒體自噬調(diào)節(jié)機制相關的信號轉(zhuǎn)導途徑，即PINK1/Parkin依賴途徑[12]和PINK1/Parkin非依賴途徑[13]。其中在不依賴PINK1/Parkin的線粒體自噬中，BH3-only促凋亡蛋白、BNIP3和FUN14結構域包含蛋白1尤為重要[14-16]。線粒體自噬相關蛋白在線粒體自噬途徑中作用于不同的節(jié)點，或單獨或互相作用，在一定程度上調(diào)控自噬的發(fā)生。

1.2線粒體動力學調(diào)控的線粒體自噬 線粒體動力學在調(diào)控線粒體自噬時發(fā)揮了重要作用。為維持其功能的完整性，線粒體參與了多種動態(tài)活動，如生物的發(fā)生、融合、裂變、轉(zhuǎn)運和自噬。同時，細胞的能量狀態(tài)與特定的線粒體形態(tài)相關。線粒體動力學(融合/裂變)和線粒體自噬是維持線粒體功能和能量穩(wěn)態(tài)的兩個關鍵細胞過程[17-19]。它們的適當調(diào)節(jié)有助于細胞存活；相反，兩者不平衡將導致細胞死亡。線粒體分裂是腦缺血后早期神經(jīng)元死亡的上游事件[20-22]。有研究證明，短暫的全腦缺血會誘導大鼠海馬CA1區(qū)線粒體的動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)短暫增加[23]。這一發(fā)現(xiàn)強化了線粒體動力學在缺血誘導的神經(jīng)元死亡中的重要作用。除分裂和融合外，線粒體膜電位在線粒體自噬中也扮演了重要角色。研究證明，PINK1和Parkin能夠介導多種細胞的線粒體自噬，且更傾向于介導去極化線粒體的清除[24]。當PINK1識別受損的線粒體時，它可以穩(wěn)定地積聚在線粒體外膜表面充當生物傳感器[25]。其激酶活性和結構的完整性是誘導Parkin易位至受損線粒體，進而激活線粒體自噬的主要條件。此外，PINK1和Parkin的平衡和相對活性也決定了線粒體膜電位的重建和電子傳遞酶的效率，以避免線粒體自噬過度而造成健康的線粒體損傷[26-27]。另有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA損傷、線粒體毒性、線粒體蛋白修飾和病毒性感染均會激活線粒體自噬[28]。

2 線粒體自噬與腦缺血再灌注損傷

腦缺血再灌注損傷是一極為復雜的病理生理過程，呈快速的級聯(lián)反應，包括神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過氧化、氧自由基損傷、凋亡基因激活、興奮性氨基酸的細胞毒性作用、炎性細胞因子損害等[29-31]。這些病理反應引起的線粒體功能紊亂、炎性損傷及細胞損傷等多種機制在腦缺血再灌注損傷進程中扮演不同角色。研究表明，腦缺血再灌注中線粒體損傷及功能紊亂是造成神經(jīng)細胞死亡的重要原因[6]。線粒體自噬作為一種清除受損線粒體的途徑，在腦缺血再灌注中起重要作用，但目前尚有爭議。自噬可以在缺血預處理中起保護作用，但一旦發(fā)生缺血再灌注損傷就會產(chǎn)生不同的作用[32-33]。在缺血再灌注14 d后線粒體自噬受到抑制，而復方腦肽節(jié)苷脂注射液能通過激活線粒體自噬改善腦缺血再灌注損傷[34]。腦卒中后的一些病理生理反應，如重度高血糖可通過抑制線粒體自噬的激活，阻礙急性缺血早期內(nèi)源性受損線粒體的清除，致使受損線粒體發(fā)生堆積，進而擴大線粒體介導的下游凋亡損傷，加重大鼠的腦梗死損傷程度[35]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后BNIP3的表達增加，其造成線粒體自噬過度激活，引發(fā)遲發(fā)性細胞死亡，加重腦缺血再灌注損傷[36]。另有研究發(fā)現(xiàn)，缺血后6 h尾靜脈注射肌肽能通過抑制自噬和線粒體自噬的激活，來達到抑制自噬性細胞死亡和保護缺血再灌注損傷的目的[37]。雖然線粒體自噬作在腦缺血再灌注損傷中所起的作用一直存在爭議，但能夠確定的是受損線粒體的過度清除和清除不足均將導致細胞死亡[38]。

2.1能量代謝障礙 線粒體通過氧化磷酸化為大多數(shù)細胞產(chǎn)生ATP，在生理條件下通過復合物Ⅰ～Ⅴ產(chǎn)生超過95%的細胞能量[39]。在幾乎所有的腦卒中動物模型中，氧化代謝均受到葡萄糖和氧缺乏的影響，這會迅速改變ATP和其他主要與線粒體有關的能量相關代謝物[40]。在線粒體基質(zhì)中，三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等均與能量代謝相關[41]。在腦缺血再灌注中，線粒體的能量代謝可通過各種機制改變。在病理條件下，缺血半暗帶中的大多數(shù)細胞在缺血2 h后仍然存活，而葡萄糖和ATP水平顯著降低，且磷酸肌酸水平降低至非缺血時的約70%[42]。相反，缺血時無氧糖酵解間接增加并產(chǎn)生大量乳酸，使細胞內(nèi)pH降低，導致多種細胞內(nèi)酶的活性降低或喪失[43]。此外，葡萄糖代謝的減少可導致丙酮酸氧化增加[44]，影響乙酰輔酶A的活化，并引起三羧酸循環(huán)的持續(xù)激活[45]，導致線粒體能量代謝異常。而再灌注能部分地恢復腦內(nèi)血流，并將葡萄糖利用率降低到缺血核心的正常范圍的一半左右[46-47]。同時，它還使ATP的水平較磷酸肌酸或腺苷酸能量電荷恢復得更慢。

2.2氧化應激過度激活 維持線粒體功能的正常對細胞功能的正常發(fā)揮至關重要。對于由高能量需求的神經(jīng)元細胞，氧化磷酸化過程極為重要。但是，線粒體的氧化磷酸化過程會伴隨活性氧類的產(chǎn)生。正常情況下，機體內(nèi)產(chǎn)生的適量活性氧類可作為信號分子參與細胞生長發(fā)育、免疫等[48]。但當發(fā)生腦缺血后，腦血流的急劇減少導致氧糖缺乏，從而引起線粒體結構異常，氧化磷酸化發(fā)生障礙。在再灌注期間，由恢復氧供引起的氧化應激反應是引發(fā)再灌注損傷的核心環(huán)節(jié)，而線粒體是其關鍵[49]。腦缺血再灌注后，興奮性氨基酸損傷、低氧、鈣超載等多種因素作用引起線粒體氧化磷酸化障礙，活性氧類生成增多，清除能力下降，導致活性氧類大量積累引發(fā)氧化應激反應，進一步加重了線粒體損傷[50]。近年來，有文獻報道了氧化應激及線粒體自噬在維護機體穩(wěn)態(tài)中的作用，其中雷帕霉素滅活介導的線粒體自噬，可通過修復氧化應激誘導的自溶酶體/溶酶體功能障礙延緩線粒體的衰老[51]。此外，活性氧類可通過激活PINK1/Parkin通路誘導線粒體發(fā)生自噬，清除受損及多余線粒體以維護線粒體健康[52]?？梢?，機體氧化應激與線粒體自噬的調(diào)節(jié)是相互的，其在一定程度上起保護細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。

2.3線粒體自噬相關蛋白的表達變化 研究發(fā)現(xiàn)，缺血后腦組織線粒體內(nèi)雖然有一定的內(nèi)源性修復機制，但并不能逆轉(zhuǎn)持續(xù)性損傷[49]。而一些藥物，如雷帕霉素[32]、復方腦肽節(jié)苷脂[34]等可通過影響線粒體膜電位及線粒體相關蛋白的表達誘導線粒體自噬，提高神經(jīng)細胞在腦缺血后的存活率，并在一定程度上改善神經(jīng)功能，對腦缺血再灌注造成的腦組織損傷起保護作用。

2.3.1PINK1和Parkin PINK1/Parkin通路調(diào)控的線粒體自噬最為典型。其中，PINK1在腦內(nèi)高度表達，能作為受損傷線粒體的分子感受器；Parkin主要介導底物泛素化，調(diào)節(jié)蛋白降解和信號轉(zhuǎn)導等。PINK1和Parkin廣泛表達于各組織和器官，尤以腦、心肌、骨骼肌等高耗能器官中含量豐富，可作為線粒體受損時的第一道防線。目前有證據(jù)表明，PINK1和Parkin參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程。氧糖剝奪/復氧可激活PINK1介導的線粒體自噬，并在其病理生理過程中發(fā)揮作用[53]。而PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬可能受多種條件影響，如活性氧類可通過激活PINK1/Parkin通路誘導線粒體發(fā)生自噬。除線粒體自噬途徑外，Parkin和Pink1還可通過其他幾種機制影響線粒體的質(zhì)量控制[54]，如PINK1和Parkin通過PINK1介導的磷酸化和Parkin介導的蛋白酶體降解線粒體銜接蛋白(Miro)影響線粒體運動，從而促進線粒體自噬去除受損的線粒體[55]。此外，Parkin通過蛋白酶體降解鋅指蛋白正向調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生，抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α的轉(zhuǎn)錄[56]。以上研究表明，Parkin以不同方式參與線粒體質(zhì)量控制和代謝的調(diào)控。

2.3.2BNIP3和Nix 腦缺血再灌注損傷的首發(fā)事件，是腦血流中斷造成的腦組織缺血缺氧。BNIP3是低氧誘導因子1的靶基因，其啟動子序列中含有低氧反應元件，低氧時能被低氧誘導因子1轉(zhuǎn)錄激活，促進BNIP3表達上調(diào)。同樣，Nix啟動子中也含有低氧反應元件，其可被低氧誘導因子1轉(zhuǎn)錄激活。在體外和體內(nèi)研究中，有學者通過模擬腦缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，低氧誘導因子1α不僅可抑制腦細胞凋亡，還能增加細胞自噬，提示低氧誘導因子1α可能通過BNIP3和Nix途徑改善腦缺血再灌注后的腦損傷，并可能對腦缺血再灌注后的腦功能持續(xù)產(chǎn)生有益作用[57]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3與微管相關蛋白1輕鏈3相互作用所致的過度線粒體自噬可引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，且Nix主要調(diào)節(jié)生理條件下基線水平的線粒體自噬，而BNIP3僅激活過度的線粒體自噬導致細胞死亡[36]。此外，BNIP3可獨立調(diào)節(jié)線粒體誘導和細胞死亡誘導的活性；為激活線粒體自噬，BNIP3作為系鏈發(fā)揮作用，將位于受損線粒體上的BNIP3連接到新生自噬體上存在的微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ[58]。同時，BNIP3還可以增加線粒體發(fā)動蛋白相關蛋白1的定位，從而刺激線粒體網(wǎng)絡的碎裂，促進受損線粒體的吞噬[59]。

2.3.3FUN14結構域包含蛋白1 據(jù)報道，含有FUN14結構域包含蛋白1的FUN14結構域在線粒體自噬中發(fā)揮重要作用，特別是在缺氧條件下[60]，但不限于缺氧條件[61]。FUN14結構域包含蛋白1含有與微管相關蛋白1輕鏈相互作用的經(jīng)典區(qū)域，可直接與微管相關蛋白1輕鏈或自噬相關蛋白8結合，誘導隨后的線粒體自噬。而敲除FUN14結構域包含蛋白1基序可抑制線粒體自噬。此外，F(xiàn)UN14結構域包含蛋白1還通過與Drp1和視神經(jīng)萎縮蛋白1[62]或鈣聯(lián)蛋白和Drp1的相互作用參與線粒體動力學調(diào)控[63]。

2.3.4線粒體融合分裂相關蛋白 缺血性腦卒中急性期的治療目標是挽救缺血性半暗帶，縮小缺血梗死灶的范圍并改善神經(jīng)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后，腦組織線粒體分裂和融合相關蛋白Drp1及視神經(jīng)萎縮蛋白1的表達水平出現(xiàn)失衡[64-66]。過度的線粒體分裂可導致線粒體斷裂是線粒體自噬過程中導致細胞死亡的關鍵步驟。已有研究證明，短暫的全腦缺血會誘導大鼠海馬CA1區(qū)Drp1的短暫增加[23]。而關于Drp1在腦缺血再灌注損傷中的作用說法不一，有研究發(fā)現(xiàn)線粒體分裂抑制劑Mdivi-1的干擾可以加重原代皮層神經(jīng)元氧糖剝奪/復氧損傷，其機制可能與它抑制Drp1向線粒體的遷移有關，通過抑制Drp1介導的線粒體分裂，來抑制自噬和線粒體自噬的發(fā)生，從而加重缺血再灌注損傷[67]。另有研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物(塞絡通膠囊、肌肽等)在腦缺血損傷早期可能通過抑制缺血再灌注后Drp1的升高，來抑制線粒體分裂異常，進而恢復線粒體的形態(tài)，維持其正常功能，從而減輕腦缺血再灌注損傷[32,68]。

2.3.5Beclin1 Beclin1是自噬的調(diào)節(jié)蛋白，且也參與了線粒體自噬。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后，Beclin1在大腦不同部位的表達水平隨缺血進程的發(fā)展出現(xiàn)升高或降低的復雜變化[69]。此外有研究表明，Beclin1不僅能在BNIP3/Nix介導的線粒體自噬通路中發(fā)揮作用，還可與PINK1相互作用，在線粒體自噬中發(fā)揮作用[70]。因此，腦缺血再灌注損傷中Beclin1水平的上調(diào)或許可以激活線粒體自噬。

3 小 結

腦卒中的發(fā)病率、病死率逐年升高，以及對社會和患者家庭的壓力，使其防治進一步得到重視。線粒體自噬通過選擇性清除線粒體，對細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及應激環(huán)境中細胞的存活均具有重要意義。很多研究顯示，可以靶向線粒體自噬來克服多種疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病、心力衰竭等[71-73]。但線粒體自噬的特殊選擇性，使其應用于臨床變得異常困難。未來，應深入研究線粒體自噬以助于更好地解析腦缺血再灌注病理過程，從而為靶向治療缺血性腦卒中提供新思路。