鄧超超 李玲玲 謝軍紅 彭正凱 王進斌 頡健輝 沈吉成 Eunice Essel

（甘肅省干旱生境作物學重點實驗室甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，蘭州 730070）

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為活躍的部分，對生態(tài)系統(tǒng)的功能及其可持續(xù)性發(fā)揮著重要作用［1-2］。其中土壤細菌種類繁多，數(shù)量最多，約占土壤微生物總量的70%～90%［3］，它直接或間接參與土壤生物化學循環(huán)，如分解與合成有機物質(zhì)，土壤結(jié)構及腐殖質(zhì)的形成等［4］。近年來，研究土壤微生物多樣性的方法越來越多，基于16S rRNA分子生物技術能夠快速、簡便地獲取包括土壤中可培養(yǎng)和未培養(yǎng)微生物的大部分信息，目前已被廣泛地應用于土壤微生物遺傳多樣性的研究［5］。董立國等［6］研究發(fā)現(xiàn)，免耕秸稈覆蓋的土壤細菌群落豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均顯著高于傳統(tǒng)耕作；林云紅等［7］研究表明，隨著小麥秸稈覆蓋量的增加土壤細菌數(shù)量呈遞增的趨勢，且顯著高于無覆蓋處理。但也有研究表明，免耕和秸稈覆蓋并未影響土壤細菌群落結(jié)構和多樣性［8-9］，這些差異可能是因研究區(qū)域、免耕和秸稈覆蓋時間長短等不同引起。然而，關于長期不同耕作措施對隴中旱農(nóng)區(qū)土壤性狀的影響，以往研究主要集中在土壤肥力［10］、團聚體［11］、有機碳［12］等方面，而在分子水平上，尤其是利用16S rRNA基因測序技術分析長期不同耕作措施土壤細菌群落構成和多樣性的研究鮮見報道［13］。因此，本研究應用高通量測序方法，對長期不同耕作措施下黃綿土土壤中細菌群落構成、物種豐度、物種多樣性進行研究，以揭示不同耕作措施下土壤細菌群落組成與結(jié)構的差異，為保護農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的提供合理了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究于2016年在位于甘肅省定西市李家堡鎮(zhèn)的甘肅農(nóng)業(yè)大學旱作農(nóng)業(yè)綜合實驗站進行，所依托田間定位試驗始于2001年。該區(qū)屬中溫帶半干旱偏旱區(qū)，太陽輻射量為592.9 kJ·cm-2，多年平均日照時數(shù)2 477 h；年均氣溫6.4℃，≥0℃積溫為2 934℃，≥10℃積溫為2 239℃，年均無霜期140 d；多年平均降水量391 mm，年蒸發(fā)量1 531 mm，為典型的一年一熟雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)。試區(qū)土壤為典型黃綿土，土層深厚，土質(zhì)較綿軟質(zhì)地較均勻，貯水性能良好。2001年和2016年豌豆地土壤主要理化特性見表1。

表1 研究區(qū)土壤主要理化特性Table 1 Physical and chemical properties of the soil in the studied area

1.2 試驗設計

試驗采用春小麥和豌豆雙序列輪作方式(豌豆-小麥、小麥-豌豆)。各序列分別設4個處理（表2），3次重復，小區(qū)面積80 m2（4 m×20 m），隨機區(qū)組排列。

表2 試驗處理及代碼描述Table 2 Description and code of the tillage treatments in the experiment

春小麥播量187.5 kg·hm-2；豌豆播量100 kg·hm-2。麥行距20 cm，豌豆行距24 cm，播深均為7 cm。春小麥播期為每年3月中旬，7月下旬至8月上旬期間收獲；豌豆于4月上旬播種，7月中下旬收獲。小麥各處理均施氮105 kg·hm-2，P2O5105 kg·hm-2；豌豆各處理均施氮20 kg·hm-2，P2O5105 kg·hm-2，播種時作基肥混施。試驗春小麥品種為“定西40號”，豌豆品種為“綠農(nóng)2號”。

1.3 樣品采集與分析

土壤樣品采集于2016年4月豌豆地，對角線五點法采集每個小區(qū)0～10 cm、10～30 cm 土樣，分層混勻后除去根系等雜物，各小區(qū)各層次土樣（共24個土樣）的一部分在田間立刻存入干冰箱帶回實驗室-80℃保存，用于分析土壤細菌群落結(jié)構；另一部分帶回實驗室，4℃保存，用于測定土壤有機碳（SOC）、土壤全氮（TN）、土壤微生物生物量碳（SMBC）、土壤微生物生物量氮（SMBN）。

SOC采用K2Cr2O7-H2SO4氧化外加熱法測定［14］。土壤全氮（TN）采用半微量開氏法測定［14］。SMBC、SMBN采用新鮮土樣氯仿熏蒸法測定［15］，0.5 mol·L-1K2SO4提取，提取液用碳氮聯(lián)合分析儀（Multi C/N 2100S德國耶拿）測定。

土壤微生物DNA提取采用美國(MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit)強力土壤DNA提取試劑盒。按照試劑盒說明書進行。用0.7%瓊脂糖凝膠電泳對土壤DNA的完整性進行檢測。

土壤細菌16S rRNA基因V4-V5可變區(qū)PCR擴增以提取的土壤微生物DNA為模板，515F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806（5′-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3′）為引物，PCR擴增細菌16S rRNA基因序列的V4-V5區(qū)。PCR擴增程序：95 ℃5 min，95 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃ 30 s，15個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對16S rRNA基因序列V4-V5區(qū)通過Illumina Hiseq平臺進行Paired-end測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

Paired-end測序得到的PE Reads首先根據(jù)overlap關系拼接應用軟件 Qiime 和 Mothur 對連接上的序列進行過濾和去除嵌合體［16-17］，然后對優(yōu)質(zhì)序列在相似性≥97%的水平上進行OTU(Operation taxonomic unit)聚類，并利用Greengene數(shù)據(jù)庫［18］進行物種注釋。采用Mothur軟件計算細菌群落豐度指數(shù)（Observed species指數(shù)和Chao指數(shù)）和多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)），測序深度用Good-coverage指數(shù)表示; 應用R軟件對OTU豐度進行主成分分析（PCA）并制圖，利用SPSS 19 進行方差分析及相關性分析。土壤微生物總DNA的提取、測序委托南京集思慧遠生物科技有限公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 不同耕作措施對相關土壤理化性狀的影響

由表3可知，秸稈覆蓋效應對0～30 cm土層土壤有機碳（SOC）、微生物生物量碳（SMBC）、土壤全氮（TN）和微生物生物量氮（SMBN）含量的影響達到極顯著和顯著水平，耕作效應僅對10～30 cm土層的SMBC和0～30 cm土層SMBN含量影響達到顯著水平，耕作、秸稈覆蓋二者的互作效應對SOC、TN、SMBC和SMBN含量的影響不顯著。同時，在0～10 cm土層中，各處理間SOC、SMBC、TN、SMBN含量呈現(xiàn)NTS處理最大，T、NT處理最小，NTS與T、NT處理差異顯著，與TS差異不顯著，NTS處理下SOC、SMBC、TN、SMBN含量較T處理分別提高28.27%、114.16%、13.51%，49.14%；10～30 cm土層SOC、SMBC、TN、SMBN含量同樣NTS處理最高，T處理最低，NTS處理下SOC、SMBC、TN、SMBN含量較T處理分別提高39.86%、98.05%、10.78%、40.72%。

2.2 不同耕作措施對土壤細菌豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)的影響

Observed species指數(shù)和Chao指數(shù)反映樣品中群落的豐度，其值越大表明群落物種的豐富度越高。香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)表示細菌群落多樣性程度，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。

不同耕作措施對0～30 cm土壤細菌群落的豐度和多樣性的影響（表4），由表可知，10～30 cm土壤細菌豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)大于0～10 cm土壤細菌群落多樣性指數(shù)，且秸稈覆蓋效應對0～30 cm土壤細菌群落豐度和多樣性影響大于耕作效應，互助效應不顯著。同時，0～10 cm土壤細菌豐度指數(shù)（Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)）和多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)）NTS最高，T或NT最低且NTS、TS與NT、T差異顯著。10～30 cm土壤細菌群落的豐度和多樣性指數(shù)大小也表現(xiàn)相同趨勢，即NTS最大，TS次之，NT、T最小。表明秸稈覆蓋能不同程度提高 0～30 cm土壤細菌群落的豐度和多樣性，尤其是免耕秸稈覆蓋效果最佳。

2.3 不同耕作措施對土壤細菌OTU豐度的影響

不同耕作措施對0～30 cm土壤細菌OTU豐度影響如（圖1）。主成分PC1和主成分PC2的樣品差異性貢獻率分別為13.29%和5.83%，合計達19.12%，是差異的主要來源。以這2個主成分為坐標軸構建的二維坐標系中，各處理在主成分分析圖上分布差異顯著。0～10 cm土層中，NTS、TS處理距離較近，位于PC1負值區(qū)域和PC2的正負兩側(cè)，NT、T處理位于PC1負值區(qū)域和PC2的正負兩側(cè)。10～30 cm土層NTS、TS和NT、T處理分布明顯， NTS、TS位于PC1和PC2正值區(qū)域，NT、T位于PC1正值區(qū)域和PC2負值區(qū)域。這一結(jié)果表明，秸稈還田處理使0～30 cm土壤細菌群落分布與豐度發(fā)生顯著變化。

表3 耕作措施對0～30 cm土層土壤理化性狀的影響Table 3 Effects of tillage practices on physical and chemical properties of the soil in the 0～30 cm soil layer

表4 不同耕作措施下0～30 cm土壤細菌豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)Table 4 Bacterial abundance index and diversity index of 0～30 cm soil under different tillage practices

2.4 不同耕作措施對土壤細菌OUT群落聚類的影響

圖1 不同耕作措施下0～30 cm土壤細菌OTU主成分分析Fig. 1 Principal component analysis of soil bacterial OTU in the 30 cm soil layer relative to tillage practice

圖2 不同耕作措施下0～30 cm土壤細菌OTU韋恩圖Fig. 2 Soil bacterial OTU Venn diagram of the soil in the 0～30 cm soil layer relative to tillage practice

如圖2所示，不同耕作措施對0～30 cm土層土壤細菌OTU具有明顯影響。0～10 cm土層中，T、NT、TS、NTS處理OTU分別為2 355、2 271、2 371、2 523，特有OTU為62、107、59、113，它們共同包含OTU為1 728。10～30 cm土層也是NTS處理OTU最多，為2547個；NT最少，為2 432。T、NT、TS、NTS處理特有OTU分別為61、65、89、105，它們共同包含OTU數(shù)為1 789。表明免耕秸稈覆蓋有利于增加土壤細菌類群。

2.5 不同耕作措施對土壤樣品細菌群落的影響

不同耕作措施下0～30 cm土壤樣品高通量測序共獲得20個門和未確定類群（圖3），其中主要優(yōu)勢類群為酸桿菌門 (Acidobacteria)、變形菌門 (Proteobacteria)和放線菌門 (Actinobacteria)，分別占平均比率為2 6.4 2%、1 9.8 6%和19.44%，其次是綠彎菌門 (Chloroflexi)、芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和擬桿菌門 (Bacteroidetes)，分別為10.98%、6.43%、6.38%和6.27%，剩余菌門占有比例相對較小，均小于1.0%，未被分類的細菌占0.4%。

圖3 門分類水平上土壤細菌群落分布比例Fig. 3 Proportion of soil bacterial community distribution at the phylum level

不同耕作措施對0～30 cm土壤細菌主要優(yōu)勢種群（酸桿菌門、變形菌門、放線菌門）結(jié)構與分布具有顯著影響（圖4）。如圖所示，在 0～10 cm土層中，各處理中變形菌門所占百分比大小為：TS＞NTS＞T＞NT，TS與NT、T處理差異顯著，與NTS差異不顯著，放線菌門、酸桿菌門在各處理中所占比例表現(xiàn)：NTS＞TS＞NT＞T ，NTS與NT、T處理差異顯著，與TS處理差異不顯著；不同耕作措施對10～30 cm土層中，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門的影響與0～10 cm土層的影響基本一致，也表現(xiàn)為NTS處理最高，T最低，NTS與T處理差異顯著。表明免耕秸稈覆蓋顯著提高了0～30 cm土層土壤細菌主要優(yōu)勢種群的豐度。

將以上各層次3種優(yōu)勢種群所占比加權求和后分別得到0～30 cm土層中酸桿菌門、變形菌門、放線菌門所占百分比大小均表現(xiàn)為：NTS＞TS＞NT＞T，其中NTS處理土壤細菌優(yōu)勢種群酸桿菌門、變形菌門、放線菌門較T處理分別提高35.11%、33.77%、30.17%，且差異達到顯著水平。

圖4 不同耕作措施下土壤細菌優(yōu)勢種群結(jié)構與分布Fig. 4 Community structure and distribution of the dominant groups of soil bacteria relative to tillage practice

2.6 土壤相關理化性質(zhì)與細菌群落多樣性間的相關關系

分析不同耕作措施下土壤理化性質(zhì)與細菌多樣性指數(shù)的相關性（表5），結(jié)果表明SOC、SMBN含量分別與Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)和辛普森指數(shù)呈極顯著和顯著正相關，TN、SMBN含量與Observed species指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)呈顯著正相關，表明提高土壤有機碳（SOC）、微生物生物量碳（SMBC）、土壤全氮（TN）和微生物生物量氮（SMBN）含量有利于土壤細菌群落的豐度與多樣性提升。

表5 土壤相關理化性質(zhì)與細菌群落多樣性相關性分析Table 5 Correlation analysis of soil physical and chemical properties and bacterial community diversity

3 討 論

3.1 不同耕作措施對土壤相關理化性質(zhì)的影響

土壤有機碳、微生物量碳、土壤全氮和微生物量氮是影響土壤肥力的重要因子［19］，本研究結(jié)果表明，秸稈還田（NTS、TS）相比傳統(tǒng)耕作有利于土壤有機碳、微生物量碳、土壤全氮和微生物量氮的累積。龐緒等［20］研究也表明免耕和秸稈還田能提高土壤表層有機碳和微生物生物量碳氮含量，這與本研究結(jié)果類似。其原因可能是保護性耕作減少了對農(nóng)田土壤的翻動，從而避免深層土壤與空氣接觸的機會，減少了土壤有機質(zhì)的氧化和礦化［21］，而且秸稈還田增加了有機物質(zhì)的輸入，促進了土壤微生物的活動，使更多的秸稈分解轉(zhuǎn)化為土壤有機質(zhì)，從而提高了土壤中有機碳、全氮和微生物量碳氮的含量［22］。

3.2 耕作措施對土壤細菌群落構成的影響

從OTU聚類Venn圖中看出，相對于傳統(tǒng)耕作，秸稈覆蓋處理不僅提高了0～10、10～30 cm土壤細菌群落的豐度和多樣性，且特有細菌類群也相對較高，其中尤以免耕秸稈覆蓋最為突出；同時酸桿菌門、變形菌門和放線菌門為隴中黃土高原區(qū)麥豆輪作系統(tǒng)土壤細菌的主要優(yōu)勢種群，免耕秸稈覆蓋處理下酸桿菌門、放線菌門和變形菌門豐度較傳統(tǒng)耕作分別提高35.11%、33.77%和30.17%。其原因是秸稈還田為微生物的生長活動提供必要的能源和營養(yǎng)物質(zhì)，刺激了土壤中微生物的活性［23］，從而加快土壤中微生物的自身物質(zhì)合成，并利用外源養(yǎng)分進行新陳代謝。同時，秸稈還田有利于土壤有機碳、土壤微生物生物量碳的累積，改善了土壤物理性狀［24］，有利于維持土壤微生物的多樣性及活性的提高。

多樣性指數(shù)是評價土壤微生物群落豐富度和多樣性的重要指標，高的多樣性指數(shù)表明高的微生物群落豐富度和多樣性［25］。本研究結(jié)果表明，秸稈還田處理（NTS、TS）下土壤細菌豐富度和多樣性指數(shù)（Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)）均大于單純的免耕和傳統(tǒng)耕作，且達到差異顯著水平，同時10～30 cm土壤細菌群落豐富度和多樣性高于0～10 cm。這與Dick［26］傳統(tǒng)耕作降低土壤細菌群落的多樣性及袁銘章等［27］土壤長期施入秸稈可提升土壤細菌群落多樣性及物種豐富度的結(jié)果相一致?？赡苁墙斩掃€田后為土壤微生物生命活動提供了有機能源［28］，改善了土壤微生物生存的生態(tài)因素，增加土壤微生物的數(shù)量［29］。此外，傳統(tǒng)耕作頻繁的翻動土壤，造成土壤結(jié)構惡化，對土壤微生物動力學有負面影響，從而顯著降低細菌的豐富度和多樣性［30］。

4 結(jié) 論

相對于傳統(tǒng)耕作，保護性耕作中秸稈還田不僅顯著增加了0～30 cm土層土壤有機碳、全氮含量，也為微生物生命活動輸入了更多的碳源和氮源，提高了土壤微生物量碳和微生物量氮，進而提高了0～10 cm、10～30 cm土層土壤細菌豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)。同時，免耕秸稈覆蓋下土壤細菌優(yōu)勢種群酸桿菌、門變形菌門、放線菌門豐度較傳統(tǒng)耕作顯著提高。因此，在隴中旱農(nóng)區(qū)推廣以免耕秸稈覆蓋為主的保護性耕作措施有利于增加土壤碳氮固存、提高土壤細菌群落豐度和多樣性和土壤的生物活性，促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。