陳吉吉 王乙然 曹文超 宋 賀 王敬國?

（1 中國農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，北京 100193）

（2 北京市環(huán)境保護監(jiān)測中心，北京 100048）

（3 安徽農業(yè)大學農學院，合肥 230036）

土壤N2O的產生途徑包括氨氧化、硝化誘導的反硝化（包括硝化細菌反硝化（Nitrifier denitrification，ND）和與硝化相耦合的反硝化（Nitrification-coupled denitrification，NCD））、異養(yǎng)硝化和異養(yǎng)反硝化過程（Heterotrophic denitrification, HD）［1］，貢獻了全球70%以上的N2O排放［2］。其中，反硝化過程，主要是異養(yǎng)反硝化微生物利用作為電子受體被逐步還原為、NO、N2O最終為N2的過程，被普遍認為是土壤N2O產生的主要途徑。但是，近年來大量研究表明，含有nirK基因的氨氧化細菌（Ammoniaoxidizing bacteria，AOB）利用氧化產生電子，還原為N2O的ND過程，同樣對土壤N2O排放具有重要貢獻［3］，在有些培養(yǎng)條件下，ND過程對土壤N2O的貢獻量甚至超過異養(yǎng)反硝化過程［4］。同時，異養(yǎng)反硝化微生物以硝化過程產生的為電子受體發(fā)生反硝化反應，稱之為與硝化相耦合的反硝化過程（NCD），同樣對N2O排放有重要貢獻［1］。此外，在高氧、碳源充足的酸性土壤和污水處理系統(tǒng)中［5］，相當數(shù)量的異養(yǎng)細菌和真菌可將NH3或有機形態(tài)的氨基氧化為，發(fā)生異養(yǎng)硝化作用，許多異養(yǎng)硝化菌同時可以進行好氧反硝化產生N2O，稱為同步硝化-反硝化過程（Simultaneous nitrification-denitrification, SND）［6］。

氧分壓是影響土壤N2O排放的重要參數(shù)。一般認為，厭氧條件下HD是土壤N2O排放的主要途徑；氨氧化是高氧分壓下土壤N2O的主要來源［7］；ND和HD對N2O的貢獻量隨著土壤氧分壓的升高而降低，且ND途徑對土壤氧分壓的耐性高于HD途徑［8］。由于土壤具有高度異質性的特點，低氧條件下各種N2O產生途徑可在不同的微域空間同時發(fā)生，被認為是促使土壤N2O排放最有利的環(huán)境［5］，但是，受各種環(huán)境因素的影響，低氧條件下各途徑對N2O排放的相對貢獻存在爭議。

為促進作物生長、增加土壤微生物活性以及改善土壤結構，我國設施蔬菜種植體系普遍會投入大量的有機肥［9］，這會顯著增加土壤碳源的有效性。土壤中充足的碳源有助于發(fā)生完全反硝化作用［10］，降低土壤N2O排放；但也有研究認為，氧分壓而不是碳源的有效性決定了N2O的還原［5,11］。反之，碳源不足會導致中間產物的累積［12］，作為硝化和反硝化過程的中間產物，與土壤N2O排放正相關［13］。碳源和氧濃度均會顯著影響土壤N2O排放，但二者交互作用對N2O排放的影響缺乏系統(tǒng)研究。

本研究選擇典型蔬菜種植區(qū)土壤，設置不同的氧分壓和有效性碳投入，研究二者對土壤N2O排放的影響；同時設置添加雙氰胺（Dicyandiamide,DCD）的處理，分析不同氧分壓（0%、1%、3%、10%和21%）和碳源投入下硝化和反硝化途徑對土壤N2O排放的相對貢獻，以期為設施菜田土壤N2O減排措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地點及土壤樣品

供試土壤采自于中國農業(yè)大學山東壽光蔬菜研究院（36°85′ N，118°87′ E）的一個日光溫室定位試驗，該試驗設置于2007年，種植系統(tǒng)為一年兩季番茄。試驗為裂區(qū)設計，主處理為滴灌和漫灌，副處理為不添加秸稈、添加小麥秸稈和添加玉米秸稈。本研究選取的土壤樣品來自于滴灌和玉米秸稈處理，該處理每個作物生長季平均滴灌量為309 mm，施肥處理N、P2O5、K2O投入量分別為204 kg·hm-2、229 kg·hm-2和526 kg·hm-2；玉米秸稈投入量為8 t·hm-2（相當于109 kg·hm-2氮以及3 406 kg·hm-2碳）；商品雞糞作為基肥，平均施用量相當于210 kg·hm-2氮和1 984 kg·hm-2碳。2014年7月番茄收獲后采集0～20 cm土壤樣品，充分混勻后過2 mm篩風干備用。該土壤樣品、含量分別為4.35、75.24 mg·kg-1，全氮1.31 g·kg-1，全碳17.9 g·kg-1，有機碳12.40 g·kg-1，有效磷150 mg·kg-1，速效鉀 483 mg·kg-1，pH 8.02。有關試驗點的更多信息可參見Fan等［14］的研究。

1.2 試驗設計與方法

以水洗后的菜田土壤為研究對象，30 mg·kg-1（以N計，下同） NH4NO3為氮源，谷氨酸鈉（C?H8NO?Na·H2O）為碳源，設置未添加谷氨酸鈉的對照處理（T1）和添加184.8 mg·kg-1（以C計，下同）谷氨酸鈉的處理（T2），兩種處理土壤同時設置不添加/添加DCD（50 mg·kg-1）的處理，研究DCD在0%、1%、3%、10%和21%氧分壓（O2/He混合氣體，下同）下對設施菜田土壤N2O的減排效果。為了進一步解釋T1土壤有氧條件下N2O產生的原因，根據(jù)氣體監(jiān)測結果，選取9個氣體產生關鍵點，同步設置平行試驗測定無碳源添加土壤培養(yǎng)過程中、和的動態(tài)變化?？偱囵B(yǎng)時間為108 h，每個處理3個重復。

具體的試驗操作為：稱取相當于10.0 g烘干土重的預處理土樣于120 mL血清瓶中，用注射器分別將去離子水或含有添加物（NH4NO3、C5H8NO4Na·H2O或DCD）的溶液均勻噴灑至土壤表面，調節(jié)土壤質量含水量為250 g·kg-1。所有血清瓶用鋁蓋密封后按處理分別用0%、1%、3%、10%、21%的氧氣和氦氣（O2/He）的混合氣（體積比）通過抽真空-洗氣系統(tǒng)（帥恩科技有限公司，北京）洗氣4次，最后一次抽真空后充入對應濃度的O2/He混合氣體，平衡血清瓶內氣壓后將所有血清瓶置于20℃恒溫水浴槽中進行培養(yǎng)，利用Robot自動培養(yǎng)系統(tǒng)每間隔6 h在線連續(xù)監(jiān)測血清瓶內N2O、N2和CO2的濃度變化。培養(yǎng)過程中根據(jù)氣體監(jiān)測結果，使用密閉注射器定期向血清瓶中補充純氧（99.9%，v/v），維持血清瓶中恒定的氧含量。

1.3 土壤氣體及相關參數(shù)測定

恒溫培養(yǎng)槽內的樣品連接Robot自動培養(yǎng)系統(tǒng)，實時在線監(jiān)測O2、N2O、N2、CO2的動態(tài)變化。該系統(tǒng)由恒溫培養(yǎng)系統(tǒng)、自動進樣系統(tǒng)和氣體分析模塊三部分組成，實現(xiàn)了培養(yǎng)、采樣、分析過程的全部自動化操作。恒溫培養(yǎng)系統(tǒng)主要包括恒溫水浴鍋(0～40℃)、血清瓶、以及固定血清瓶位置的鐵架構成（可放置44個120 mL的血清瓶）；自動進樣系統(tǒng)由自動進樣器（Gilson Model 222，Gilson，法國）和蠕動泵（Gilson Minipuls 3，Gilson，法國）構成，通過Python編程語言控制自動采樣功能；氣體分析模塊由包含熱導檢測器（TCD）、電子捕獲檢測器（ECD）和火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜（Agilent 7890A，美國）組成，能夠監(jiān)測N2O（ECD、TCD）、N2（TCD）、CO2（TCD）和O2（TCD）的含量。該系統(tǒng)最大的優(yōu)勢是能夠準確檢測N2的變化且采樣過程中N2的滲氣率較低。相關Robot自動培養(yǎng)系統(tǒng)的運行模塊細節(jié)可參見Molstad等［15］的描述。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每批測量試驗開始時，放置3個已知濃度的標氣瓶，根據(jù)在線監(jiān)測的血清瓶中氣體數(shù)值和標氣濃度，利用挪威生命科學大學NMBU研究小組的計算方法（https://www.nmbu.no/en/research/groups/nitrogen/approaches-and-infrastructure）計算上述氣體產生量，計算過程中同時考慮了采樣過程中由于回注等量He氣造成的稀釋效應、N2和O2的漏氣影響、氣體在各溫度和pH下的溶解度以及在氣液兩相之間的擴散率，具體請參見Molstad等［15］的研究。

不同氧分壓下氣態(tài)產物的產物比用N2O/(N2O+N2)指數(shù)（IN2O）計算求出，其計算公式如下［17］：

式中，無氧處理的N2O(t)、N2(t)為N2O測量值達到高峰時間(t)下的累積產生量，mg·kg-1；有氧處理的時間節(jié)點是培養(yǎng)結束時。

2 結 果

2.1 不同氧分壓下碳源添加對設施菜田土壤N2O、N2產生量的影響

由圖1可見，在厭氧條件下，未添加和添加碳源土壤N2O的排放量分別于在線培養(yǎng)后的18、24 h達到5.42 mg·kg-1和6.02 mg·kg-1的排放峰值，并于30 h全部轉化為N2，且硝化抑制劑是否添加對N2O產生量無顯著影響。

隨著土壤氧分壓的升高，N2O排放量呈指數(shù)下降（圖2）。1%氧分壓下未添加硝化抑制劑和碳源的處理N2O累積排放量顯著高于厭氧處理N2O的排放量（P＜0.01）。在氧分壓大于等于1%的條件下，未添加碳源土壤N2O排放量均高于添加碳源的處理，但是在1%氧分壓同時添加DCD和碳源的條件下，土壤N2O排放量顯著高于僅添加DCD的土壤（P＜0.01），分別為4.21 mg·kg-1和2.61 mg·kg-1。 DCD的添加顯著降低了有氧條件下未添加碳源土壤N2O和N2產生量，在1%、3%、10%和21%氧分壓下，與未添加DCD的處理相比，添加DCD后未添加碳源的處理N2O產生量分別降低了64.4%、88.8%、83.5%和76.3%；添加DCD同時導致1%和3%氧分壓下N2累積產生量分別降低了23.4%、18.6%。DCD的添加對添加碳源處理的N2O和N2產生量均無顯著影響。

圖1 不同氧分壓下不同處理土壤培養(yǎng)過程中N2O和N2濃度的動態(tài)變化Fig. 1 Dynamics of the concentrations of N2O and N2 in the soil under incubation relative to treatment and oxygen partial pressure(OPP)

圖2 氧分壓與N2O排放量間的相關性 (n=60)Fig. 2 Relationship between oxygen partial pressure and N2O emission (n=60)

厭氧條件下N2O和N2排放量顯著高于有氧處理（P＜0.01），最高達到23.5 mg·kg-1。隨著氧分壓的增加，土壤N2O和N2排放量迅速下降。從1%氧分壓時的10.3 mg·kg-1（未添加碳源處理）和6.74 mg·kg-1（添加碳源處理），分別下降至3%氧分壓時的2.94 mg·kg-1和0.68 mg·kg-1。同時，培養(yǎng)瓶頂空氧分壓高于3%后，添加碳源土壤的N2O和N2排放峰值顯著低于未添加碳源的土壤（P＜0.01）。

當氧分壓高于3%以后，土壤N2排放量很低且可能存在較大的誤差，因此，僅計算了前三個氧分壓處理的N2O/(N2O+N2)（IN2O）值（表1）。1%氧分壓下全部處理，以及未添加DCD和碳源的3%氧分壓處理的IN2O普遍高于其余各氧分壓處理，其中，未添加碳源土壤在3%與1%氧分壓下IN2O無顯著差異，均顯著高于厭氧處理。碳源的添加顯著降低了土壤的IN2O，而DCD的添加則僅顯著降低了未添加碳源土壤的IN2O。添加碳源和DCD的處理IN2O對氧分壓的響應類似，即在1%氧分壓下IN2O最高，0%氧次之。

質量平衡計算結果顯示，在有氧和無氧條件下均有氮的凈礦化，而且厭氧條件下兩種處理中土壤的礦化量顯著低于有氧處理（P＜0.01），最高達到17.0 mg·kg-1。DCD有效抑制了土壤的氨氧化，未添加碳源處理的土壤尤為顯著（P＜0.01）。同時，在不同氧分壓下，添加碳源的處理培養(yǎng)前后NH4+含量無顯著降低現(xiàn)象，即使在21%氧分壓下，培養(yǎng)結束時不添加/添加DCD的處理N含量分別為50.0 mg·kg-1和55.2 mg·kg-1（谷氨酸鈉添加帶入了43.12 mg·kg-1的氮）。

表1 不同氧分壓下以N2O/(N2O+N2) （IN2O）指數(shù)表示的產物比Table 1 Gaseous product ratio ［N2O/(N2O+N2) index (IN2O)］ relative to oxygen partial pressure (OPP)

2.2 不同氧分壓下無碳源添加處理培養(yǎng)過程中無機氮動態(tài)

未添加碳源土壤培養(yǎng)過程中無機氮動態(tài)監(jiān)測的結果（圖3）顯示，厭氧條件下也會發(fā)生短暫的積累，累積量在12 h達到峰值，為18.9 mg·kg-1。在1%、3%和10%氧分壓下，未添加DCD處理的累積時間、累積量顯著高于厭氧和21%氧分壓處理，三種氧分壓下最高的累積量出現(xiàn)在培養(yǎng)開始后72 h，分別為25.7、30.6和31.5 mg·kg-1（圖3a）。

圖3 無碳源添加處理培養(yǎng)過程中無機氮的動態(tài)變化Fig. 3 Dynamics of inorganic nitrogen in the soil under incubation without available carbon added

3 討 論

隨著土壤氧分壓的升高，N2O排放量呈指數(shù)下降，土壤N2O排放主要發(fā)生在厭氧和1% 氧分壓下（圖2）。厭氧條件下土壤N2O主要來自HD過程，且在本試驗條件下，厭氧處理土壤N2O的排放量被明顯低估，這是因為在封閉培養(yǎng)體系中，大量的N2O很快會被進一步還原為N2，而在田間實際條件下，大部分N2O將被釋放進入大氣，這也是室內培養(yǎng)試驗普遍存在的問題［18］，大量N2O被還原導致本研究中無碳源和DCD添加的處理在微量氧（1% O2）下N2O累積產生量顯著高于厭氧處理（P＜0.01）。在持續(xù)微量氧供應條件下，各處理土壤中N2O排放量以較高的速率不斷增加；當土壤氧分壓增加至3% O2后，僅在未添加碳源的處理中表現(xiàn)出N2O的持續(xù)排放，與相同處理條件下的1%氧分壓處理相比，N2O和N2O加N2排放量仍分別降低了78.2%和71.3%，表明土壤氧分壓高于3%后，即使是在碳源充足的條件下，N2O排放量、氮素氣態(tài)損失顯著降低［19］。農田土壤N2O排放主要發(fā)生在施肥和灌水后的脈沖式排放，特別是設施菜田土壤，在全年17.5%的時間內排放了約78.8%的N2O［20］。由此可見，田間狀態(tài)下，土壤N2O排放量中的絕大部分來自于厭氧和低氧的微域環(huán)境，當土壤空氣中的氧分壓普遍高于3%后，以氨氧化及其相關過程等途徑來源的N2O表現(xiàn)為脈沖式排放后的土壤N2O背景排放。氨氧化過程中N2O排放主要源于中間產物NH2OH氧化，但是土壤中幾乎無NH2OH累積，且僅有1/3的NH2OH氧化酶活性位點可能會將NH2OH氧化為N2O［21］，導致該過程N2O產生量很低，一般不超過氨氧化量的1‰～2‰［22］。NH2OH或NO2-的化學分解也會造成N2O排放，但該途徑主要發(fā)生在低pH土壤中［23］。

在碳源較為充足的條件下，HD過程對設施菜田土壤N2O排放的貢獻量更大，只是隨著氧分壓的升高，其貢獻的比例顯著降低。添加碳源的處理中，DCD對土壤N2O、N2產生量和IN2O均無顯著影響，且在添加DCD的1%氧分壓下，添加碳源的處理N2O排放量顯著高于無碳源添加的處理（P＜0.01）（圖1）。此外，與無碳源添加的土壤相比，氨氧化量顯著降低，即使在21%氧分壓下，也無顯著的氨氧化現(xiàn)象發(fā)生。由此可見，碳源的添加可能會造成有氧條件下異養(yǎng)菌對自養(yǎng)菌生長產生競爭優(yōu)勢［24］，導致有氧條件下N2O可能主要來自HD過程。添加碳源后可能會有部分N2O來自異養(yǎng)硝化-反硝化過程（SND），因為有氧且碳源充足的條件有利于異養(yǎng)硝化作用的發(fā)生［25］，但本研究所用土壤pH較高，且添加DCD的處理培養(yǎng)前后硝酸鹽基本平衡，異養(yǎng)的同步硝化-反硝化過程或許很弱。

在低氧（1%～3% O2）且無碳源添加的土壤中，異養(yǎng)反硝化菌可能會通過HD 或NCD途徑對土壤N2O排放產生重要貢獻。DCD的添加顯著降低了無碳源添加處理土壤N2O排放量（P＜0.01），這與田間通量觀測結果一致［26-28］，且大量研究結果也表明，低氧且低碳源環(huán)境會顯著增加ND途徑對N2O的貢獻量［29］，但不能以此推測ND途徑是微量氧條件下N2O排放的主導途徑。例如，在微量氧1% O2分壓下，無DCD添加的處理產物比IN2O指數(shù)為0.69，添加DCD后IN2O為0.57，根據(jù)產物比下降的幅度，可以推算出在微量氧供應情況下，約有82.6%的N2O來自HD和NCD過程，17.8% N2O來自于ND等過程。即在微量氧供應條件下，N2O排放中的絕大部分來自于分別以和為底物的異養(yǎng)反硝化過程。以同樣方式計算，在3%O2分壓下HD和NCD過程對N2O排放的貢獻量為57.4%，42.6%的N2O主要來自ND過程。硝化抑制劑同樣會降低廣義的HD途徑氮素損失，主要原因可能是DCD添加后NCD過程的底物含量降低［30］。NCD過程在本質上仍然是HD過程［31］，在氧擴散受阻的情況下好氧微生物對土壤孔隙氧的消耗會導致微域土壤產生厭氧微位點，造成氨氧化過程產生的通過異養(yǎng)反硝化途徑損失。Petersen等［32］研究結果表明，有氧-厭氧的土壤環(huán)境會導致70%的硝化產物通過反硝化途徑損失，Lee等［30］也觀察到土壤中硝化與反硝化潛勢呈正相關。由此可見，與自養(yǎng)的氨氧化微生物相比，在微量氧和低氧且無碳源添加的土壤中，異養(yǎng)菌可能對土壤N2O排放和氮素氣態(tài)損失更為重要。對比1%和3%氧分壓下N2O排放量也可以看出，盡管氨氧化和ND過程在3%氧分壓下對N2O貢獻量顯著增加，但N2O的排放量較1%氧分壓時下降了78.2%，因而，總體上ND過程對設施菜田土壤N2O排放的貢獻不大。

有些條件下，土壤中ND途徑對N2O的貢獻量有可能被高估。例如，本研究表明，在1%、3%和10%氧分壓下，均存在較長時間的過渡性積累（圖3a），但僅在1%氧分壓下出現(xiàn)大量的N2O排放。通常認為，硝化微生物進行ND的目的是解除對其細胞的毒害作用［8］。由此可以推論，當土壤中出現(xiàn)大量積累時，就有可能伴隨著通過ND途徑排放大量N2O的現(xiàn)象。這一假設顯然與本研究的結果不符。認為有氧條件下ND過程是土壤N2O排放主導途徑之一的結論，主要來自于在低氧條件下利用同位素標記方法進行的試驗［3-4］。然而，利用雙同位素技術計算排放途徑的前提，是假定氨氧化產生的僅能被氨氧化菌所利用，進行反硝化過程并釋放出N2O［33］。這種假設或許存在下列不足：首先，土壤中有許多異養(yǎng)反硝化菌對和有相同的異養(yǎng)還原能力；其次，部分異養(yǎng)菌由于缺少還原基因僅能以為底物進行反硝化作用，因此，利用雙同位素標記法得到的結果可能會高估ND途徑對N2O排放的貢獻［1,34］。

4 結 論

隨著土壤氧分壓的升高，N2O排放量呈指數(shù)下降，土壤N2O排放主要發(fā)生在厭氧和微量氧（1%O2）情況下，氧分壓大于等于3%后，土壤N2O排放量、氮素氣態(tài)損失顯著降低。在低氧條件下（0%～3% O2），總體上異養(yǎng)反硝化菌對設施菜田土壤N2O排放更為重要，特別是在碳源較為充足的條件下。田間實際條件下，在保證作物產量的前提下，適當?shù)奶荚赐度?、通過水分管理控制土壤空氣中氧分壓以及減少低氧與厭氧的“熱點”，并結合施用硝化抑制劑，對降低菜田土壤N2O排放有重要意義。