王 濤，譚 琦，李 玉，李正鵬，郭力剛，周 峰*

(1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306； 2 國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403)

杏鮑菇(PleurotuseryngiiQuel)是一種廣泛用于工廠化栽培的珍稀食用菌。從20世紀(jì)末開始，中國已成為杏鮑菇產(chǎn)量增長最快的國家[1]。2016年我國杏鮑菇產(chǎn)量達(dá)到110萬t，產(chǎn)值達(dá)65億元(人民幣，下同)，占同期國內(nèi)食用菌總產(chǎn)量的31%，預(yù)計2020年我國杏鮑菇市場規(guī)模將達(dá)到122億元[1]。目前，我國杏鮑菇栽培企業(yè)主要使用固體菌種，質(zhì)量不穩(wěn)定；而在食用菌工廠化生產(chǎn)水平較高的韓國，杏鮑菇栽培企業(yè)已全部使用液體菌種，品質(zhì)較好，每年大量出口歐洲和北美等高端市場[2-3]。

液體菌種在我國沒有被廣泛推廣的主要原因之一是發(fā)酵條件與工藝技術(shù)不成熟[4]。國內(nèi)對杏鮑菇液體菌種的研究大都停留在實(shí)驗(yàn)室階段，基本是使用三角瓶模擬食用菌發(fā)酵罐的生長環(huán)境進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)[5-6]。本研究在引進(jìn)韓國先進(jìn)的液體接種機(jī)、空氣凈化系統(tǒng)等成套工廠化設(shè)備的基礎(chǔ)上，對杏鮑菇液體菌種應(yīng)用工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為推廣應(yīng)用液體菌種技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

杏鮑菇XH菌株，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

韓國液體接種機(jī)(D.M.S KOREA公司)，液體菌種300 L發(fā)酵罐(上海松仕機(jī)械設(shè)備有限公司)，無菌空氣過濾系統(tǒng)(上海芹瑞機(jī)械設(shè)備有限公司與D.M.S KOREA公司提供)，蘑菇滅菌器(連云港國鑫食用菌成套設(shè)備有限公司)，出菇房培養(yǎng)調(diào)控系統(tǒng)(荷蘭AEM公司)。

1.3 生產(chǎn)工藝流程

液體菌種工廠化栽培流程為：搖瓶培養(yǎng)基制作→搖瓶接種→搖床培養(yǎng)→發(fā)酵罐清洗→發(fā)酵罐培養(yǎng)基制作→滅菌→冷卻→接種(發(fā)酵罐)→菌絲發(fā)酵培養(yǎng)(通入無菌空氣)→接種(栽培瓶)→發(fā)菌培養(yǎng)→出菇管理。

1.4 無菌空氣產(chǎn)生流程

發(fā)酵罐菌絲培養(yǎng)過程中需要通入無菌空氣，無菌空氣產(chǎn)生流程為：外界空氣→空氣壓縮機(jī)→儲氣罐→冷凍式干燥機(jī)→空氣過濾器→吸附式干燥機(jī)→細(xì)菌過濾器→減壓閥→空氣過濾膜→發(fā)酵罐。

1.5 培養(yǎng)基及菌種培養(yǎng)方法

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15—20g，水1 000mL，pH自然。

液體培養(yǎng)基：白砂糖20g，豆粕粉3 g，磷酸二氫鉀0.8 g，硫酸鎂0.7 g，水1 000mL。

栽培培養(yǎng)基：木屑45%，玉米芯20%，麩皮15%，米糠15%，玉米粉5%，含水量65%—67%。

液體母種制備方法為：將PDA母種培養(yǎng)基4—5塊(每塊0.5cm2)接種至裝有150mL液體培養(yǎng)基的三角瓶(250mL)中，在22℃下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為140r/min，培養(yǎng)時間為7—10d。

液體菌種發(fā)酵罐制備：配方同以上液體培養(yǎng)基。先將白砂糖、豆粕粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂在同一容器內(nèi)加適量水充分溶解混勻，再倒入發(fā)酵罐中，定容至250 L，并加入12.5 mL硅酮乳液型消泡劑，121℃滅菌2h，滅菌后立即水淋冷卻。待培養(yǎng)基溫度降至25℃以下時，接入三角瓶中的液體母種。接種時同時通入無菌空氣使發(fā)酵罐內(nèi)保持正壓，然后置于22℃下培養(yǎng)7d。

1.6 栽培瓶接種與出菇管理

將液體菌種發(fā)酵罐接種管連接接種機(jī)，通氣壓力調(diào)節(jié)為0.15 MPa。栽培瓶為1 100mL塑料瓶，裝瓶量為750g，滅菌(121 ℃ 2 h)后冷卻至25℃以下接種。接種后的栽培瓶轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室，在20—23 ℃、空氣相對濕度75%、CO2質(zhì)量濃度2 000—3 000 mg/kg條件下發(fā)菌，待菌絲發(fā)滿整個栽培瓶5d后進(jìn)行搔菌出菇。搔菌后的栽培瓶在14—18℃、空氣相對濕度85%—99%、CO2質(zhì)量濃度1 000—1 500 mg/kg的栽培房內(nèi)倒扣8d，之后翻轉(zhuǎn)栽培瓶，使子實(shí)體在相同環(huán)境中生長、發(fā)育。待子實(shí)體菌蓋伸展，邊緣略內(nèi)卷即可收獲。

1.7 發(fā)酵罐液體菌種最佳培養(yǎng)條件試驗(yàn)

通過L9(33)正交試驗(yàn)，確定最適的通氣壓力、搖瓶母種接種量、培養(yǎng)基初始pH，試驗(yàn)因素水平見表1。培養(yǎng)7d后，使用韓國液體接種設(shè)備連接栽培瓶，接種量22—25g，之后進(jìn)入菌絲培養(yǎng)與出菇管理階段。

表1 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)設(shè)計

1.8 液體接種栽培瓶接種量試驗(yàn)

使用1.7節(jié)所得出的最佳培養(yǎng)條件，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵罐連接接種機(jī)進(jìn)行栽培瓶接種，接種時通氣壓力為0.15 MPa，設(shè)定接種機(jī)噴射時間分別為0.15s、0.35 s、0.50s、0.65s和0.80s，使接種量產(chǎn)生差異，每處理48個重復(fù)。記錄發(fā)滿瓶所用的時間，后熟10d后搔菌，進(jìn)行出菇試驗(yàn)。

1.9 最佳后熟時間試驗(yàn)

采用以上最佳培養(yǎng)條件與接種量，在栽培瓶發(fā)滿菌絲后的1—19d內(nèi)，每天取48瓶進(jìn)行搔菌，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，記錄每瓶的產(chǎn)量。

1.10 液體菌種與固體菌種對比試驗(yàn)

采用以上得到的最佳發(fā)酵條件、最佳接種量、最佳后熟時間等進(jìn)行出菇試驗(yàn)，并與固體菌種生產(chǎn)進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體菌種最佳培養(yǎng)條件試驗(yàn)

由表2可見，以菌絲發(fā)滿瓶所用的時間為指標(biāo)，菌絲發(fā)滿瓶越快，培養(yǎng)期越短，即可以減少生產(chǎn)與管理成本。極差分析表明，影響因素大小依次為接種量>pH>通氣壓力，最佳培養(yǎng)條件組合為接種量150mL、通氣壓力0.050 MPa、初始pH 6.3。

表2 發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 最佳接種量試驗(yàn)

接種機(jī)噴射時間為0.15 s、0.35 s、0.50 s、0.65 s、0.80 s對應(yīng)的栽培瓶接種量分別為11 g、18 g、24 g、33 g、45g。由表3可見，當(dāng)接種量變大時，菌絲發(fā)滿瓶所用的時間也會變短，接種噴射時間為0.65s和0.80s的處理與0.15s、0.35s、0.50s處理的菌絲發(fā)滿瓶時間有顯著或極顯著差異，這可能是因?yàn)榻臃N量越大，液體菌種與培養(yǎng)料的接觸點(diǎn)就越多，從而使發(fā)菌點(diǎn)增多。但從單瓶產(chǎn)量來看，接種量過大(0.65s、0.80s)時，產(chǎn)量下降并與其他接種量的產(chǎn)量有極顯著差異。這可能是由于接種量過大，使培養(yǎng)基含水量超過最佳含水量的范圍，從而影響了產(chǎn)量。綜上，接種機(jī)噴射最佳時間為0.50s。

表3 接種機(jī)最佳接種量試驗(yàn)結(jié)果

注：LSD法進(jìn)行多重比較分析，同行不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)

2.3 最佳后熟時間試驗(yàn)

如圖1所示，過短的后熟時間會影響杏鮑菇的產(chǎn)量，隨著后熟時間的延長，菌絲吸收養(yǎng)分和水分增多，產(chǎn)量相應(yīng)提高，從第6天開始產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，每瓶在160g以上，但后熟時間過長，菌絲老化，從第15天開始，產(chǎn)量緩慢下降。從節(jié)能的角度考慮，培養(yǎng)時間越短，培養(yǎng)房消耗的能量越少，周轉(zhuǎn)越快，因此建議在后熟第6—15天根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況安排搔菌出菇。

圖1 單瓶產(chǎn)量隨后熟時間變化情況Fig.1 Changes of yield per bottle along with after-ripening time

2.4 液體菌種與固體菌種對比試驗(yàn)

如表4所示，液體菌種發(fā)滿瓶時間比固體菌種快近6d，具有極顯著差異，但出菇時間上沒有表現(xiàn)出優(yōu)勢；產(chǎn)量上液體菌種比固體菌種有所提高，具有顯著差異。液體菌種每瓶菇的個數(shù)多于固體菌種，子實(shí)體平均質(zhì)量小于固體菌種，通常每瓶子實(shí)體為2—3個時有利于工廠化瓶栽杏鮑菇的利潤最大化[7]，因此在液體菌種的應(yīng)用中需要注重控制出菇子實(shí)體個數(shù)的技術(shù)研發(fā)。液體菌種在菇型方面(包括全長、柄長、蓋徑、柄徑等)與固體菌種無顯著差異。

表4 液體菌種與固體菌種出菇試驗(yàn)比較

注：LSD法進(jìn)行多重比較分析，同列“**”、“*”分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)

3 討論

本研究使用液體菌種發(fā)酵罐和韓國先進(jìn)的液體接種機(jī)等設(shè)備，在工廠化栽培條件下，確定了杏鮑菇液體菌種發(fā)酵罐最適的接種量、通氣壓力、初始pH以及最佳接種時間。接種量和通氣壓力的增加有助于側(cè)耳屬菌絲體內(nèi)多糖和二糖的合成，促進(jìn)菌絲生長[8]。本研究得出接種機(jī)噴射時間為0.50s時可以得到最佳的接種量，此接種量可以使菌種在栽培瓶內(nèi)達(dá)到較快的生長速度，又不會導(dǎo)致瓶內(nèi)培養(yǎng)料含水量過高而影響出菇。試驗(yàn)表明，菌絲發(fā)滿瓶的速度與接種量成正相關(guān)，但接種量過大產(chǎn)量反而下降，或許是因?yàn)楹窟^大引起的[9]。在實(shí)際生產(chǎn)中，當(dāng)裝瓶攪拌過程中培養(yǎng)基含水量較低時，可通過增加接種過程的液體接種量來補(bǔ)充培養(yǎng)基水分，但栽培料攪拌過程中加水與接種時加水物理特性可能會有不同。韓國有研究指出，可通過改變配方來改善培養(yǎng)基物理特性或營養(yǎng)特性，提高貨架期和產(chǎn)量[10]，也可以通過改進(jìn)機(jī)械設(shè)備促進(jìn)培養(yǎng)基對菌液的吸收[11]，這些工藝都有待進(jìn)一步探索并應(yīng)用于生產(chǎn)。

本試驗(yàn)中，最佳后熟時間是6—15d。有研究認(rèn)為，后熟可使菌絲體生長達(dá)到所需的積溫[12-13]，本試驗(yàn)杏鮑菇生長溫度為21℃，若提高環(huán)境溫度使菌絲生長較快地達(dá)到所需的積溫，可減少后熟時間。但環(huán)境溫度的提高也有可能引起“燒菌”[14]，因此液體菌種的后期栽培工藝也可以進(jìn)一步優(yōu)化。近年的生產(chǎn)實(shí)踐和研究表明，出菇期溫濕度精細(xì)管控對杏鮑菇產(chǎn)量有顯著的影響[15-16]。

綜上，本研究對杏鮑菇液體菌種應(yīng)用工藝參數(shù)的優(yōu)化可為進(jìn)一步推廣其生產(chǎn)提供指導(dǎo)。