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豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的以腹瀉、嘔吐、脫水以及哺乳仔豬高致死率為特征的高度接觸性腸道傳染病[1]。主要表現(xiàn)為：7日齡仔豬死亡率高達100%；保育豬和育肥豬感染PEDV后出現(xiàn)腹瀉、消瘦；母豬腹瀉、無乳等，給豬場造成巨大的經(jīng)濟損失。豬流行性腹瀉于1971年首次報道于英國，隨后在比利時發(fā)現(xiàn)該病[2]。我國于1976年首次報道PED，并于1980年首次分離到PEDV[3]。2009年，韓國報道了PEDV毒株S基因發(fā)生變異[4]。我國于2010年底出現(xiàn)了高致病性豬流行性腹瀉病毒變異株，且在以后的流行病學調查分析中均發(fā)現(xiàn)有PEDV變異株的流行[5]。2013年美國出現(xiàn)S-INDEL變異株OH851[6-7]，Yamamoto等[8]也報道了一種低致病性PEDV S-INDEL。目前變異株S-INDEL和Non S-INDEL在美國、中國和日本流行[9]。PEDV變異株持續(xù)席卷養(yǎng)豬業(yè)，其致病力及致死率達到了空前高度，因此，探究PEDV在分子水平上的變異是防控該病的基礎。本研究對福建、浙江、山東、河南4個省份5家豬場疑似豬流行性腹瀉豬群的肝、脾、肺及肺門淋巴結、腸絨毛、腸系膜淋巴結等病料樣品進行RT-PCR擴增，并對陽性樣品S1基因及ORF3基因進行序列測定。通過對5家暴發(fā)PED豬場豬流行性腹瀉抗原檢測及序列分析，分析當前PED的流行情況、遺傳變異規(guī)律及其免疫失敗的可能原因，為更好地防控該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 病料采自福建、浙江、山東、河南地區(qū)豬場疑似豬流行性腹瀉豬群的肝臟、脾臟、肺臟、肺門淋巴結、腸絨毛、腸系膜淋巴結等。

1.2 主要試劑 taco TMDNA/RNA Extraction Kit購自金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司；AMV反轉錄酶、HPRI、Random primer、DL1000 DNA Marker和dNTPs（2.5 mmol/L）、prime STAR○RMax（2×）均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 陽性樣品抗原的確定 采用檢測引物對5家豬場的 送檢樣品進 行PEDV、PCV、PRRSV、HCV、TGEV、PRV抗原常規(guī)的RT-PCR（PCR）檢測，確定樣品中抗原的感染情況及PEDV陽性樣品。

1.3.2 S1、ORF3基因引物設計與合成及病毒核酸的提取 參照GenBank中登錄的PEDV S基因及ORF3基因序列，通過Primer Permier 5.0和Oligo 7.0軟件在其保守區(qū)設計引物，引物序列及病毒核酸提取參照[10-11]。

1.3.3 PEDV S1、ORF3基因的RT-PCR擴增與測序以PEDV陽性樣品的cDNA為模板，用所設計的特異性引物進行RT-PCR擴增，反應體系50μL：其中2×Max 25μL、上下游引物（20μmol/m L）各1μL、cDNA 1μL，補充去離子水至終體積為50μL。PCR反應條件：98℃預變性2 min，98℃變性10 s；58℃退火5 s，72℃延伸5 s，30個循環(huán)。反應結束后，擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產(chǎn)物送上海立菲生物技術有限公司進行序列測定。

1.4 序列分析 應用Lasergene 7.0軟件、MEGA4.0軟件對PEDV流行株S1部分基因及ORF3基因進行核苷酸同源性及遺傳進化分析。

2 結果與分析

2.1 陽性樣品的確定 采用檢測引物對5家豬場的送檢樣品進行PEDV、PCV、PRRSV、HCV、TGEV、PRV抗原常規(guī)的RT-PCR（PCR）檢測，確定5份陽性樣品中均存在PEDV。其中pedv-ZJL、pedv-HeNY存在與PRRSV和HCV混合感染，pedv-SML存在與PRRSV混合感染，pedv-SDCH存在與HCV混合感染的情況，檢測結果見表1。

2.2 S1基因、ORF3基因的PCR擴增 采用RTPCR方法對5株PEDV S1部分基因及ORF3基因進行擴增，結果獲得與預期結果一致的目的條帶。其中S1基因目的條帶大小1 129 bp，ORF3基因目的條帶大小728 bp（見圖1）。

2.3 S1基因、ORF3基因遺傳進化及核苷酸同源性分析 S1基因核苷酸同源性及遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，構建的進化樹分為兩大分支GⅠ、GⅡ；5株流行株均位于GⅡ分支，其中pedv-SML株、pedv-SDCH株同屬于S-INDEL， 與Italy/69979-25/2015株（KY009941）、OH851 株（KJ399978）、270SVN2015株（KT206205），IA2-2013株（KF468754）親緣關系較近，其核苷酸同源性高達99.1%以上；pedv-HeNZ株、pedv-ZJL株同屬于Non S-INDEL，與TW-ping-Tung-52 -2014 株 （KP276252）、AH2012 株（KC210145）、LZW2012（KJ777677）親緣關系較近，其核苷酸同源性高達98.5%以上。5株流行株相互間核苷酸同源性為97.2%～98.5%（見圖2-圖3）。

ORF3基因核苷酸同源性及遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，5株流行株均屬于野毒株，其中pedv-ZJL株、pedv-HeNY株、pedv-SML株與變異株Tottori2/JPN/2014（LC022792）、KNU-141112-P10株（KR873435）親緣關系較近，其核苷酸同源性高達100%，其相互間的核苷酸同源性高達99.6%～99.7%（見圖4-圖6）。

表1 5份送檢樣品不同類型抗原檢測結果

圖1 5份樣品S1基因、ORF3基因RT-PCR擴增結果

圖2 5株PEDV流行株S1基因核苷酸同源性分析

圖3 5株PEDV流行株S1基因遺傳進化分析

3 討 論

圖4 5株PEDV流行株ORF3基因核苷酸同源性分析

圖5 5株PEDV流行株ORF3基因遺傳進化分析

本研究對4個不同省份5家豬場送檢的樣品進行PEDV、PCV、PRRSV、HCV、TGEV、PRV等病原檢測，結果發(fā)現(xiàn)：PED的流行大多伴隨著豬瘟病毒和豬藍耳病病毒的混合感染；對PEDV陽性樣品ORF3基因及其S1部分基因生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：5株PEDV毒株與當前中國豬流行性腹瀉病毒變異株親緣關系較近，與參考株CV777株及早期的分離株親緣關系較遠。S1基因遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)：5株PEDV病毒株同屬于GⅡ分支，其中pedv-SML、pedv-SDCH屬 于S-INDEL；pedv-HeNY、pedv-HeNZ、pedv-ZJL屬于Non-S-INDEL；ORF3基因核苷酸同源性及遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)5株病毒株處于同一個大分支，其相互間核苷酸同源性為98.5%～99.9%；利用MEGA4.0軟件對ORF3基因進行序列比對發(fā)現(xiàn)，5株病毒株均為野毒株，均存在49 bp的插入。5株流行株與Tottori/JPN/2014株變異株親緣關系較近，其核苷酸同源性高達98.8%～100%。提示當前豬流行性腹瀉仍以野毒感染為主，且豬流行性腹瀉病毒在不斷發(fā)生變異。

圖6 5株PEDV流行株ORF3基因核苷酸比對分析

2010年，我國暴發(fā)了以變異株為主的PED[12]，也報道了CV777疫苗對變異毒株無法提供完全的免疫保護力[13]。PEDV流行株與疫苗株抗原的差異是導致免疫失敗的一個重要原因。本研究對當前PEDV流行株生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，當前PEDV仍以變異株為主，既存在S-INDEL變異株，也有Non S-INDEL變異株。這一結果與Yamamoto R等[8]報道一致。Wang等[14]對2015年7個區(qū)域的PEDV進行分子特征分析，發(fā)現(xiàn)41家豬場29株分離株S1基因均屬于Non S-INDEL，指出中國出現(xiàn)的S-INDEL株具有遺傳多樣性，且與Non S-INDEL株循環(huán)交替發(fā)生。

豬流行性腹瀉仍然是導致仔豬高致死率的疾病之一，究其原因，可能是由于豬瘟、豬繁殖障礙與呼吸綜合征等免疫抑制病混合感染引起PED免疫失敗。與PEDV持續(xù)暴發(fā)不無關系，新變異株的持續(xù)出現(xiàn)使得現(xiàn)有疫苗的免疫保護效果大打折扣。Lin等[15]對YC2014株變異株攻毒保護試驗分析發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的滅活苗（DR3或CV777制成的疫苗）不能保護仔豬免受YC2014毒株的侵害，而YC2014株滅活苗可以對仔豬感染YC2014株提供100%的免疫保護。此外，豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗臨床使用情況及市場調查分析發(fā)現(xiàn)：免疫PED-TGE二聯(lián)活疫苗（HB08株+ZJ08株）的豬群與免疫同類產(chǎn)品（經(jīng)典株）相比，豬場發(fā)病的概率和損失均較低，表明流行株對PEDV變異株的免疫保護效果優(yōu)于經(jīng)典株。故選擇合適毒株的疫苗免疫豬群顯得尤為重要。