余 潮，錢開宇

(1.東莞市道滘醫(yī)院泌尿外科，廣東 東莞 523176； 2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院生物樣本庫，武漢 430071)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球男性腫瘤中位居第七位，在女性中位居第十七[1]；在中國男性腫瘤中居第六位，在女性中位排在十五位之后。我國的膀胱癌發(fā)病率雖然低于歐美發(fā)達(dá)國家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢[2]。目前,膀胱癌的病因不明，手術(shù)是最主要的治療方式。然而，非肌層浸潤性膀胱癌經(jīng)尿道切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率為50%～70%，且有10%～25%的患者復(fù)發(fā)后進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌[3-4]。肌層浸潤性膀胱癌具有很強(qiáng)的侵襲性，需要采用根治性膀胱切除術(shù)治療，然而根治術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率仍接近50%[5]，5年生存率僅為50%～66%[6-7]。亟需探索更加有效的膀胱癌預(yù)防和治療方法。

辣椒素是辣椒屬植物中存在的一種天然物質(zhì)，具有辛辣刺激味道，廣泛用于食品添加劑和鎮(zhèn)痛藥。研究人員通過體外實驗發(fā)現(xiàn)辣椒素對多種腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用[8]，對辣椒素抗腫瘤作用的研究逐步受到重視。1997年，Caterina等[9]從大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中克隆出了一種辣椒素受體，并證明該受體在功能上是一種非選擇性離子通道；在結(jié)構(gòu)上類似于瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)離子通道家族，因是最早被發(fā)現(xiàn)的香草酸受體，故命名為瞬時受體電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)[10]。TRPV1與多種腫瘤相關(guān)，但作用機(jī)制尚未完全明確。目前對于TRPV1和辣椒素對膀胱癌影響的研究報道較少，本研究對TRPV1及其激動劑辣椒素在膀胱癌中的作用進(jìn)行綜述。

1 TRPV1

TRPV1蛋白由838個氨基酸組成，分子量為95 000，由6個跨膜蛋白(位于細(xì)胞膜上)和長度可變的N端和C端(位于細(xì)胞內(nèi))組成。其中第5和第6個跨膜蛋白之間的疏水基團(tuán)內(nèi)嵌，從而形成一個離子通過孔道[10-11]。最初報道TRPV1分布于背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)[9]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在多種神經(jīng)組織中均有分布，包括下丘腦、小腦、大腦皮質(zhì)紋狀體、中腦等。在膀胱、肝臟等非神經(jīng)組織中均能檢測到TRPV1的表達(dá)[12-13]。最新研究還發(fā)現(xiàn)，TRPV1不僅表達(dá)于細(xì)胞膜，在神經(jīng)元、心肌細(xì)胞和許多癌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上也均有表達(dá)[14]。

TRPV1具有兩大生理功能：傷害性刺激感受器和非選擇性離子通道。作為傷害性刺激感受器，TRPV1可被多種疼痛性刺激激活，包括溫度>43 ℃的傷害性熱刺激、pH<5.9的酸性環(huán)境以及香草酸類物質(zhì)(辣椒素、樹膠脂毒素)等。作為一種非選擇性離子通道，TRPV1對二價離子的通透性大于一價離子，尤其對Ca2通透性高，具體為Ca2>Mg2+>Na+≈K+≈Cs+，對Ca2和Mg2+的通透性分別是Na+的10倍和5倍左右[9,15]。TRPV1通道因在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2水平中起作用，所以對細(xì)胞的多種生理活動具有重要調(diào)節(jié)功能。激活TRPV1通道后可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和細(xì)胞核Ca2水平增高，導(dǎo)致細(xì)胞受損，甚至介導(dǎo)細(xì)胞死亡，最終消除表達(dá)TRPV1的細(xì)胞[16-17]。

TRPV1的活性可由蛋白激酶A、蛋白激酶C、Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ等激酶通過磷酸化特定的殘基進(jìn)行調(diào)節(jié)。Ser-116位點的磷酸化在蛋白激酶A介導(dǎo)的TRPV1脫敏調(diào)節(jié)中至關(guān)重要；Thr-144、Thr-370和Ser-502位點在蛋白激酶A介導(dǎo)的TRPV1的磷酸化/致敏化中發(fā)揮重要作用。蛋白激酶C主要作用于Ser-502和Ser-800位點，不僅增強(qiáng)辣椒素或質(zhì)子誘發(fā)的反應(yīng)，而且還降低溫度閾值，使得受體在生理條件下(37 ℃)具有活性。鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ主要作用于Ser-502和Thr-704位點，在辣椒素激活TRPV1中發(fā)揮重要作用。除磷酸化外，TRPV1的活性可以通過N-糖基化、氧化還原狀態(tài)等方式調(diào)節(jié)[18]。

TRPV1激動劑和拮抗劑分為外源性和內(nèi)源性兩大類。外源性激動劑有：辣椒素、樹膠脂毒素、NGX-4010、zucapsaicin、大麻二酚等[10,19]。內(nèi)源性激動劑有：大麻素、N-花生四烯乙醇胺、N-花生四烯酰多巴胺、N-油酰胺多巴胺等[19]。內(nèi)源性拮抗劑為resolvin D2。外源性拮抗劑有：辣椒平、BCTC、iodo-resiniferatoxin、SB-366791、AMG-9810、A-425619、JNJ-17203212等[19]。各種研究中使用較多的外源性激動劑為辣椒素、樹膠脂毒素，使用較多的外源性拮抗劑為辣椒平。

2 TRPV1與膀胱癌

人體下尿路中密集分布著對辣椒素敏感的初級傳入神經(jīng)元，這些神經(jīng)元同時發(fā)揮疼痛感知的傳入功能和逼尿肌收縮的傳出功能，所以早期對TRPV1在膀胱內(nèi)功能的研究多關(guān)注于治療疼痛性膀胱綜合征以及神經(jīng)源性和非神經(jīng)源性膀胱過度活動癥[20]。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TRPV1除與疼痛相關(guān)外，還在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、肝癌等腫瘤中發(fā)揮作用，甚至與腫瘤惡性程度和(或)預(yù)后相關(guān)[21-24]。以下詳述TRPV1在膀胱癌中的作用。

2.1 TRPV1在膀胱癌組織中的表達(dá)與分期分級相關(guān) 關(guān)于膀胱癌組織中TRPV1表達(dá)的變化最早由Lazzeri等[25]于2005年報道。研究者收集了13例正常膀胱組織、16例淺表性膀胱癌組織和12例肌層浸潤性膀胱癌組織進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRPV1在正常膀胱上皮中的表達(dá)高于在膀胱癌中，并且在膀胱癌中，癌細(xì)胞分化越差表達(dá)越低，腫瘤分期越高表達(dá)越低。研究者還采用免疫組織化學(xué)染色研究TRPV1在組織中的具體表達(dá)位置，發(fā)現(xiàn)在正常膀胱上皮中，TRPV1在淺表細(xì)胞的表達(dá)高于基底細(xì)胞和棒狀細(xì)胞；在淺表性膀胱癌中，TRPV1表達(dá)較正常膀胱上皮降低；在肌層浸潤性膀胱癌組織中，淺表細(xì)胞中偶爾檢測到散在的極低的TRPV1表達(dá)，在基底細(xì)胞和肌層浸潤性膀胱癌中則未檢測到TRPV1表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡實驗也證實，正常膀胱上皮中TRPV1蛋白表達(dá)量最高，淺表性膀胱癌稍低，肌層浸潤性膀胱癌中明顯降低，在T4期膀胱癌患者中檢測不到TRPV1蛋白表達(dá)。Kalogris等[26]進(jìn)一步研究各種不同分期、分級的膀胱癌組織中TRPV1的表達(dá)，納入Ta期膀胱癌8例，T1期16例，T2期18例，T3期 12例，T4期8例，并以5例正常膀胱活檢組織為對照，研究結(jié)果顯示從腫瘤分期上看，從Ta和T1期(非肌層浸潤性膀胱癌)到T2、T3和T4期(肌層浸潤性膀胱癌)的組織中TRPV1的mRNA表達(dá)逐漸降低，在T3～T4期膀胱癌組織中的表達(dá)量僅為在正常組織中的1/10左右；從病理分級上看，TRPV1的mRNA 的表達(dá)隨著分級的增高逐漸減少，并且與腫瘤分期無關(guān)。研究者進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)染色，也證實膀胱癌組織中TRPV1蛋白的表達(dá)也隨著腫瘤分期增加而顯著降低。更為重要的是，該研究還發(fā)現(xiàn)TRPV1表達(dá)下調(diào)的患者生存期顯著縮短，采用多因素Cox回歸分析進(jìn)一步表明，TRPV1的表達(dá)可以作為膀胱癌預(yù)后的獨立危險因素，TRPV1表達(dá)減少是膀胱癌的獨立負(fù)性預(yù)后因子。

與以上研究者的觀點不同，曾有研究者認(rèn)為，之前研究中檢測到的只是尿路上皮中的感覺神經(jīng)纖維末梢，而尿路上皮本身不表達(dá)TRPV1[27]。針對這種質(zhì)疑，Sterle等[28]對18例經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切的乳頭狀尿路上皮癌患者進(jìn)行研究，采用蛋白質(zhì)印跡實驗和免疫熒光染色以及掃描電子顯微鏡對正常尿路上皮、低級別和高級別膀胱尿路上皮癌中TRPV1的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRPV1不僅由傳入神經(jīng)表達(dá)，在正常分化的尿路上皮中也有表達(dá)，與正常尿路上皮相比，低級別膀胱尿路上皮癌組織中TRPV1的表達(dá)下降，而高級別癌組織中進(jìn)一步下降，證實TRPV1確實在尿路上皮中表達(dá)。

綜上，TRPV1在人體尿路上皮中表達(dá)，在高級別和(或)高分期的膀胱癌組織中逐漸降低，TRPV1表達(dá)下調(diào)是膀胱癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子，膀胱癌的發(fā)生發(fā)展與TRPV1表達(dá)的降低密切相關(guān)。

2.2 TRPV1在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)與惡性程度相關(guān) 細(xì)胞系是進(jìn)行體外實驗研究的基礎(chǔ)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要基因在細(xì)胞系中通常有差異表達(dá)。常用的膀胱癌細(xì)胞系有5637、RT4、T24、UM-UC-3、J82、TCCSUP等，目前已有數(shù)位研究者對TRPV1在膀胱細(xì)胞系中的表達(dá)進(jìn)行了研究。Amantini 等[29]采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)實驗及蛋白質(zhì)印跡實驗均證實，TRPV1在高分化低級別的RT4細(xì)胞中高表達(dá)，但在低分化高級別的J82、EJ和TCCSUP細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，提示TRPV1在細(xì)胞系中的表達(dá)隨著惡性程度增高而減少。進(jìn)一步對5637 和RT4細(xì)胞的研究充分證明了TRPV1在膀胱癌細(xì)胞中的作用。相對于5637細(xì)胞，RT4細(xì)胞高表達(dá)TRPV1。RT4細(xì)胞經(jīng)TRPV1激動劑辣椒素處理后活性明顯降低，但5637細(xì)胞經(jīng)辣椒素(100 μmol/L)處理后反而活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為促進(jìn)血管生成(血管生成素1、血管生成素2和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)上調(diào))，促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)(基質(zhì)金屬蛋白酶1、基質(zhì)金屬蛋白酶9、顆粒酶A等上調(diào))。為了探究以上RT4和5637細(xì)胞的表現(xiàn)不同是否由TRPV1導(dǎo)致，研究者將TRPV1的cDNA序列轉(zhuǎn)染至5637細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后高表達(dá)TRPV1的5637細(xì)胞被辣椒素處理后顯示出細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加、生長抑制和凋亡，與辣椒素處理RT4細(xì)胞的效果相同。為了確認(rèn)此結(jié)果，研究者進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入TRPV1拮抗劑辣椒平后，辣椒素對轉(zhuǎn)染后高表達(dá)TRPV1的5637細(xì)胞的生長抑制作用消失[30]。以上實驗結(jié)果充分表明，辣椒素對膀胱癌細(xì)胞的抑制效果是通過TRPV1發(fā)揮作用的，正是由于TRPV1在不同膀胱癌細(xì)胞系的表達(dá)量不同，所以辣椒素處理后的結(jié)果也大不相同，甚至相反。鄭龍等[31]研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1在膀胱癌RT4、5637、T24細(xì)胞中的表達(dá)也是隨著細(xì)胞惡性程度的增高而逐漸減少，辣椒素對這三種細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)依次為 49.40 μmol/L、152.52 μmol/L、336.18 μmol/L，表明辣椒素對膀胱癌的生長抑制也是RT4細(xì)胞最敏感，5637細(xì)胞次之，T24最小，與國外研究者的報道相符[29]。

3 TRPV1與辣椒素

辣椒素是一種常用的TRPV1激動劑，由于天然存在于辣椒屬植物中而得名，其化學(xué)名稱為反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺，是人們感受到辣椒辛辣刺激味道的主要物質(zhì)來源，可以引起從輕微發(fā)熱感至燒灼感的不同強(qiáng)度的感覺。辣椒素激活TRPV1后可以使疼痛傳入神經(jīng)元釋放P物質(zhì)，而持續(xù)激活則使P物質(zhì)耗竭，最終使得疼痛不能感知和傳導(dǎo)，從而發(fā)揮止痛效果[8,10,30]?，F(xiàn)已證實8%辣椒素貼片對于手術(shù)創(chuàng)傷后疼痛、皰疹后神經(jīng)痛、多發(fā)性神經(jīng)病變和混合性疼痛綜合征安全有效[32]。除止痛作用外，辣椒素還有抗腫瘤作用，對胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膽管癌等多種腫瘤均有抑制作用，但其作用機(jī)制尚不完全明確[33-34]。

需要特別注意的是，辣椒素雖然是TRPV1激動劑，但實際上辣椒素可通過多種機(jī)制發(fā)揮作用，并非都是依賴TRPV1介導(dǎo)的，所以不能混淆辣椒素和TRPV1的作用。在上述辣椒素(100 μmol/L)誘導(dǎo)5637細(xì)胞后侵襲性反而更強(qiáng)，研究者也指出高劑量(500 μmol/L)的辣椒素可以誘導(dǎo)細(xì)胞大量死亡，但細(xì)胞死亡是因為細(xì)胞毒作用，與TRPV1通道無關(guān)[30]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素在多種腫瘤中可以誘導(dǎo)活性氧生成，而發(fā)揮抗腫瘤作用，該作用不依賴TRPV1通道。Qian等[35]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素誘導(dǎo)活性氧升高，通過轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O3a介導(dǎo)途徑抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。Gonzales等[36]發(fā)現(xiàn)TRPV1表達(dá)于口腔鱗狀細(xì)胞癌中，使用辣椒素可以顯著抑制癌細(xì)胞活性，但使用辣椒平預(yù)處理并不能逆轉(zhuǎn)這種效果，并且單獨使用辣椒平也能抑制癌細(xì)胞活性。研究者由此推測辣椒素的作用機(jī)制并非激活TRPV1，進(jìn)一步使用鈣成像技術(shù)等證實香草酸類物質(zhì)的抗腫瘤作用是通過誘導(dǎo)活性氧生成和繼發(fā)的細(xì)胞凋亡，而不是依賴TRPV1激活實現(xiàn)的。此外，辣椒素還可以通過其他多種途徑抑制癌細(xì)胞。例如，Lau等[37]報道辣椒素可以誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，但證實是通過TRPV6介導(dǎo)的，而不是通過TRPV1途徑。

綜上，辣椒素可以通過誘導(dǎo)活性氧升高、線粒體膜電位喪失促進(jìn)細(xì)胞凋亡，引起周期阻滯，抑制癌細(xì)胞增殖等多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用，并非均需要激活TRPV1，所以必須對辣椒素的作用和TRPV1的作用予以區(qū)別。

4 辣椒素與膀胱癌

目前對于辣椒素在膀胱癌中的作用的研究報道并不多。辣椒素可以通過多種途徑抑制膀胱癌。Lin等[38]報道辣椒素可降低膀胱癌細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的表達(dá)水平，造成細(xì)胞周期阻滯，抑制膀胱癌增殖。該研究還發(fā)現(xiàn)辣椒素下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中腫瘤相關(guān)的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞自發(fā)性凋亡，減少細(xì)胞遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低細(xì)胞遷移能力。Yang等[39]報道辣椒素以劑量依賴性方式降低膀胱癌T24細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生和線粒體膜去極化，在濃度超過100 μmol/L以上時導(dǎo)致T24細(xì)胞死亡，但并未發(fā)生明顯的凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素的上述作用可以被辣椒平逆轉(zhuǎn)，提示該效應(yīng)可能是通過TRPV1介導(dǎo)的。Qian等[35]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素處理膀胱癌5637和T24細(xì)胞后引起細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6水平下降，造成G0/G1細(xì)胞周期阻滯；上皮鈣黏素、β聯(lián)蛋白升高，神經(jīng)鈣黏素水平下降，抑制膀胱癌細(xì)胞遷移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)辣椒素誘導(dǎo)活性氧升高，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶2和FOXO3a升高，可通過轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O3a介導(dǎo)途徑抑制膀胱癌增殖。Yang和Qian的研究中均進(jìn)行了免疫缺陷鼠皮下荷瘤實驗證實，辣椒素抑制體內(nèi)膀胱癌細(xì)胞移植瘤的生長[35,39]。此外，Gilardini等[40]報道辣椒素可以通過CD91激活樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，而激活樹突狀細(xì)胞是獲得T細(xì)胞介導(dǎo)的持久有效的抗腫瘤免疫的關(guān)鍵。該研究提示，辣椒素是一種很有希望的抗膀胱腫瘤藥物，值得深入研究。

可見，辣椒素可導(dǎo)致活性氧增多，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期阻滯、增殖遷移能力下降，還可能通過激活免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡，最終對膀胱癌發(fā)揮抑制作用。

5 小 結(jié)

TRPV1作為一種非選擇性離子通道，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2水平，對細(xì)胞功能具有重要調(diào)節(jié)作用。在膀胱癌細(xì)胞系中，TRPV1的表達(dá)隨著細(xì)胞系惡性程度增高而降低；在膀胱癌組織中，TRPV1表達(dá)隨著分期和(或)分級的增高而降低；在膀胱癌患者中，TRPV1表達(dá)下調(diào)的患者生存期顯著縮短，故TRPV1有望在膀胱癌診斷、治療和預(yù)后判斷中發(fā)揮作用。

辣椒素是TRPV1的天然激動劑，可以通過誘導(dǎo)活性氧升高，引起細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及激活抗腫瘤免疫等多種方式抑制癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。在研究過程中需要區(qū)分辣椒素的作用與TRPV1的作用。