張夢(mèng)瑤 汪水風(fēng) 邵毅

干眼(dry eye，DED)是一種以淚膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失為特征的眼表多因素疾病，伴有淚膜不穩(wěn)定性，且具有高滲性、眼表炎癥與損傷以及神經(jīng)感覺(jué)異常等[1]。DED的患病率為5%～50%[2]，女性和老年人的比例更高[3]。最近，Tear Film and Ocular Surface Society(TFOS)與國(guó)際干眼研討會(huì)( International Dry Eye Workshop，DEWS)一致認(rèn)為，淚液高滲性和不穩(wěn)定性是其核心病因。其定義了2種主要的亞型：(1)蒸發(fā)性干眼(evaporative dry eye，EDE)，其中淚液高滲性是淚液在正常淚腺功能下過(guò)度蒸發(fā)的結(jié)果；(2)缺水性干眼(aqueous-deficient dry eye，ADDE)，其中高滲性是由正常淚液蒸發(fā)速率下淚液分泌減少引起的[4]。

DEWS委員會(huì)強(qiáng)調(diào)，高滲性和炎癥對(duì)干眼的影響很大[1]。在一些淚液分泌功能正常的情況下，淚膜功能差或淚液成分蒸發(fā)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致淚膜滲透壓增加[5]，這會(huì)使眼表處于高滲狀態(tài)。DED患者中淚液滲透壓升高可誘導(dǎo)眼表炎癥。VanDerMeid等[6]發(fā)現(xiàn)淚液滲透壓升高與細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1α、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)]和基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9、10水平增加呈正相關(guān)。DED患者可出現(xiàn)結(jié)膜鱗狀上皮化生、杯狀細(xì)胞減少、上皮細(xì)胞凋亡增多，CD4+、CD8+T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞角結(jié)膜浸潤(rùn)增多[7]。淚腺發(fā)炎可能會(huì)產(chǎn)生含有粗鹽細(xì)胞因子的異常淚液，從而破壞眼表，激活血管和淋巴管生成，加重炎癥，導(dǎo)致眼表?yè)p傷、視力損傷和其他相關(guān)癥狀[4]。

目前，干眼無(wú)法治愈，其治療旨在改善癥狀，常規(guī)治療方法是應(yīng)用人造眼淚，抗炎和局部免疫抑制，可用于改善慢性炎癥的癥狀[4]。類固醇治療法是DED相關(guān)炎癥最常用的短期治療法，但不推薦長(zhǎng)期使用[4]。環(huán)孢素A是

源自真菌的免疫抑制肽，用作DED治療的抗炎局部滴劑。由于近年來(lái)對(duì)DED的關(guān)注[4]，新的再生策略的出現(xiàn)，使DED的治療有了質(zhì)的進(jìn)步。

1 血紅素衍生物

使用不同血液制品，在DED以及其他難治性重癥病例的治療中取得了顯著進(jìn)展[8]。目前，最常見(jiàn)的制劑是使用自體或同種異體血清滴劑、血小板衍生的血漿產(chǎn)品和臍帶血血清(autologous serum，AS)[9]。

1.1 自體ASAS的生物力學(xué)和生物化學(xué)特性與正常淚液相同，AS中包含許多抗菌因子，如：IgG、溶菌酶和補(bǔ)體，有抑制細(xì)菌的作用[10]。血液是血液凝固后收集的全血液體部分。可以通過(guò)離心去除凝塊，并將所得上清液(AS)制備成滴劑[8]。1975年有研究者應(yīng)用自體AS治療眼部堿性損傷[11]，1984年，Tsubota等[12]首次將其成功應(yīng)用于DED患者。1999年，AS應(yīng)用于不同眼表疾病的輔助治療開(kāi)始被廣泛接受[13]。自體AS中，存在包括生長(zhǎng)因子在內(nèi)的正常淚液中的各種物質(zhì)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor，TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factors，PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子P物質(zhì)(substance P，SP)、細(xì)胞因子、抑菌因子(乳鐵蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白)、纖連蛋白、維生素A。其中維生素A在角膜上皮細(xì)胞的移行和黏附過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，加速了眼表上皮的再生與修復(fù)[14]。已知TGF-β具有劑量依賴性抗增殖特性，其平均水平通常比自然眼淚高5倍，所以通常將其稀釋20%使用，避免產(chǎn)生影響上皮損傷愈合的潛在危害。然而未稀釋的血清在各種眼部手術(shù)術(shù)后角膜上皮細(xì)胞遷移和上皮愈合中更有效，其原因可能是纖連蛋白濃度較高，縮短了愈合時(shí)間并降低了慢性上皮缺陷和并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[15]。自體AS的制備過(guò)程中白細(xì)胞的存在增加了促炎細(xì)胞因子：IL-6、IL-1 和TNF等水平，免疫球蛋白和補(bǔ)體對(duì)許多遭受免疫學(xué)改變的患者可能是有害的[16]。AS儲(chǔ)存必須在-20 ℃的冷凍箱中進(jìn)行，使用前必須解凍，如果要儲(chǔ)存24 h至1周，則必須保存在4 ℃的冰箱中。AS滴眼液必須在生產(chǎn)后的3個(gè)月內(nèi)使用[17]。自體AS中通常不含有防腐劑，因此降低了防腐劑誘導(dǎo)產(chǎn)生毒性的風(fēng)險(xiǎn)[12]。使用體積分?jǐn)?shù)20%AS滴眼液可治療許多眼表疾病，尤其是DED，其中AS能抑制眼表上皮細(xì)胞凋亡并增加DED中的杯狀細(xì)胞密度[18]。AS滴眼液可以促進(jìn)缺損的角膜上皮愈合、減輕眼部癥狀，減少因角膜屏障功能受損導(dǎo)致的并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[19]。

1.2 異基因血清來(lái)自健康人的異基因血清(allogeneic serum，ALS)是在當(dāng)患者AS不適合、無(wú)法使用或無(wú)法進(jìn)行重復(fù)采血的情況下使用的，包括病毒感染、敗血癥、嚴(yán)重貧血患者和多系統(tǒng)疾病的老年患者[20]。

ALS的應(yīng)用促進(jìn)了一些具有大量炎癥和系統(tǒng)性成分的免疫介導(dǎo)疾病，這時(shí)應(yīng)避免將含有高濃度促炎細(xì)胞因子的ALS直接轉(zhuǎn)移至眼睛[20]。另一方面，ALS可以產(chǎn)生大量的眼淚促進(jìn)治療后的眼部修復(fù)，使細(xì)胞因子、抗感染因子的組成標(biāo)準(zhǔn)化和篩選成為可能[20]。

1.3 富血小板血漿富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)包括來(lái)自患者自身血液的各種成分，可以通過(guò)離心獲得血小板濃度高于循環(huán)血液中的血漿部分[21]。富血小板的α 顆粒含有凝血因子和生長(zhǎng)因子，被激活后血小板聚集，并最終由顆粒釋放各種生長(zhǎng)因子，如PDGF、EGF和TGF-β，從而激發(fā)炎癥和傷口愈合的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，然后參與傷口愈合和止血。已證實(shí)這些生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及免疫功能皆有重要的調(diào)節(jié)作用[22]。Dohan Ehrenfest等[23]將PRP成品按所含成分的不同分為純PRP(pure platelet-rich plasma，P-PRP)、富白細(xì)胞和血小板血漿(leukocyte-rich and platelet-rich plasm，L-PRP)、純富血小板纖維蛋白(pure platelet-rich fibrin，P-PRF)和富白細(xì)胞和血小板纖維蛋白(leukocyte-rich and platelet fibrin，L-PRF)4種主要類型。

白細(xì)胞對(duì)PRP的質(zhì)量影響很大。白細(xì)胞增加分解信號(hào)分子，例如與白細(xì)胞濃度密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9，MMP-9)。白細(xì)胞與PDGF和分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平呈正相關(guān)，與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)水平呈負(fù)相關(guān)。全血中非血小板成分的作用有助于富血小板血漿的生物活性，特別是紅細(xì)胞和白細(xì)胞參與不必要的炎癥反應(yīng)可能是有害的。盡管白細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生負(fù)面的促炎作用[24]，但其他研究表明，非血小板的細(xì)胞成分對(duì)于理想的血小板功能是很重要的，包括生成凝血酶形成強(qiáng)大的凝血能力，釋放生長(zhǎng)因子，并由此產(chǎn)生的血清刺激細(xì)胞增殖能力等[25]。關(guān)于富含生長(zhǎng)因子的血漿滴眼液的應(yīng)用，對(duì)常規(guī)治療無(wú)效果的嚴(yán)重DED患者的護(hù)理取得了很好的效果[26]，在中性粒細(xì)胞性疾病治療中特別成功[27]。最后，富含生長(zhǎng)因子的血漿可用于支持角膜緣干細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同的研究評(píng)估了不同富血小板血漿制劑對(duì)淚膜質(zhì)量和癥狀嚴(yán)重程度均有所改善，即使以前用自體血清治療的患者也是如此[24]。富血小板血漿的使用有一定的禁忌證，如拔牙期、嚴(yán)重心臟病、活動(dòng)性細(xì)菌感染，以及某些病毒性傳染病(乙型病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征等)病史。

1.4 臍帶血血清像末梢血清一樣，臍帶血血清(umbilical cord blood serum，UCS)含有高濃度的淚液成分。與AS相比，EGF和TGF-β水平分別高3倍和2倍。UCS具有較高的NGF和SP水平和較低的IGF-1和維生素A水平，但均高于正常淚液中的水平[16]。UCS由于含有抗菌劑如免疫球蛋白G、溶菌酶和補(bǔ)體，顯示出抑菌效果[26]。與AS滴眼液相比，UCS滴眼液更有效地減輕DED癥狀并具有上皮營(yíng)養(yǎng)作用，可以增加嚴(yán)重DED患者的杯狀細(xì)胞密度[16]。在分娩時(shí)可以從臍靜脈中抽取大量樣本，從而可以同時(shí)滿足幾個(gè)患者的需求。但必須評(píng)估過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)和傳播腸外疾病的可能性[28]。

UCS滴眼液建議使用體積分?jǐn)?shù)為20%，通常每天滴4～6次。在20 ℃下可儲(chǔ)存3～6個(gè)月[16]。其已被用于治療各種眼表疾病，包括有或沒(méi)有肖格倫綜合征的嚴(yán)重干眼、移植物抗宿主病中的眼部并發(fā)癥、持續(xù)性上皮缺陷、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜病、角膜糜爛的復(fù)發(fā)以及眼部化學(xué)灼傷和角膜屈光手術(shù)的表面問(wèn)題等[29]。

2 干細(xì)胞治療

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞(multipotent stromal cells，MSCs)(自動(dòng)/同種異體)起源于中胚層，具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，這種干細(xì)胞能夠分化成硬骨、軟骨、脂肪和其他類型的細(xì)胞，還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用[30]。由于MSCs缺乏主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)表達(dá)和共刺激分子(如CD40、CD80和CD86)，從而可以逃避T細(xì)胞和天然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的識(shí)別和作用，所以其可以以同種異體方式使用[31]。未分化細(xì)胞的儲(chǔ)庫(kù)已經(jīng)在不同的成人或胚外組織中分離，用于其所在組織的再生[32]。其向細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子釋放的病灶部位呈現(xiàn)遷移和歸巢能力[33]。已經(jīng)在眼中鑒定出不同的MSCs樣細(xì)胞群：基底角膜緣、角膜基質(zhì)、小梁網(wǎng)、脈絡(luò)膜和眶周脂肪[34]。不同的細(xì)胞類型存在于角膜表面，如上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)中起基本作用[35]。

MSCs對(duì)適應(yīng)性免疫和固有免疫均有較強(qiáng)的免疫抑制作用，如直接的細(xì)胞間接觸和分泌不同可溶性物質(zhì)等，主要包括TGF-β、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、前列腺素E2、IL-10、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indolamine2，3-dioxygenase，IDO)、一氧化氮、血紅素氧合酶1等[30]。研究表明，MSCs分泌的外基質(zhì)除了直接作用于常駐靶點(diǎn)之外，還能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[36]。MSCs對(duì)適應(yīng)性免疫的抑制作用主要表現(xiàn)在對(duì)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用，對(duì)固有免疫的抑制作用主要表現(xiàn)在對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞的免疫抑制作用[30]。MSCs的主要免疫調(diào)節(jié)機(jī)制之一是通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞接觸和其分泌物的抑制分子調(diào)節(jié)T細(xì)胞(CD4+和CD8+)[36]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是外周免疫耐受的細(xì)胞介質(zhì)，并且其缺失會(huì)導(dǎo)致過(guò)度的多系統(tǒng)自身免疫[37]。另一方面是使用同種異體細(xì)胞來(lái)治療疾病。嚴(yán)重的DED角膜表面是有損傷的[4]。角膜上皮細(xì)胞層和更深的基質(zhì)層的損傷會(huì)涉及到在角膜緣區(qū)域中的祖細(xì)胞——角膜緣上皮干細(xì)胞(limbal epithelial stem cells，LESCs)活化介導(dǎo)的愈合過(guò)程[37]。LESCs的大量損失會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的角膜上皮缺損和角膜結(jié)膜化[38]。MSCs表現(xiàn)出角膜上皮前體細(xì)胞的形態(tài)特征，檢測(cè)出角膜上皮前體細(xì)胞的標(biāo)志，包括Integrin D1、Cx43、Pax6和P63等，這說(shuō)明在適宜條件下，MSCs能夠誘導(dǎo)分化為角膜上皮前體樣細(xì)胞，角膜緣生態(tài)位在除了存在角膜分化的角膜緣上皮干細(xì)胞/祖細(xì)胞群之外，還有一群MSCs位于其下面在角膜表面再生中起重要作用[39]。MSC治療在實(shí)驗(yàn)性DED模型中改善了淚液量和淚膜穩(wěn)定性，增加了上皮恢復(fù)和杯狀細(xì)胞數(shù)目。

目前LESCs移植是歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)唯一授權(quán)的用于修復(fù)角膜表面病變的細(xì)胞療法。移植的MSCs通過(guò)產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)了角膜傷口的愈合，而不是直接轉(zhuǎn)化為角膜細(xì)胞[38]。形成角膜瘢痕是角膜傷口愈合的主要并發(fā)癥。MSCs的抗瘢痕能力已被廣泛報(bào)道[38]：角膜成纖維細(xì)胞(激活的基質(zhì)角膜細(xì)胞)的遷移及其反應(yīng)受到多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)，這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子是調(diào)節(jié)角膜成纖維細(xì)胞遷移的重要因素。已顯示MSCs是血管生成的良好激活劑，并分泌VEGF[35]。然而，MSCs似乎對(duì)角膜血管生成具有相反的作用，上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1；一種強(qiáng)大的抗血管生成因子)的表達(dá)，并顯著下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(一種炎癥相關(guān)的促血管生成因子)[40]?？傊诳寡?、免疫調(diào)節(jié)、抗血管生成、眼淚生成和角膜傷口愈合等多種作用(減少嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，幫助上皮恢復(fù)，減少結(jié)膜瞼板腺損傷數(shù)量以及增加杯狀細(xì)胞)，MSCs成為了治療DED的希望[40]。

2.2 MSCs分泌體MSCs分泌體通過(guò)自分泌或旁分泌的方式，改善機(jī)體局部微環(huán)境，促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞向傷口部位的遷移和分化，挽救瀕臨凋亡的細(xì)胞，從而達(dá)到修復(fù)組織的目的。MSCs分泌因子在功能上主要可分為免疫調(diào)節(jié)、抗細(xì)胞凋亡、血管發(fā)生、支持干/祖細(xì)胞的增殖與分化、化學(xué)趨化、抗瘢痕6大類[41]。如上所述，MSCs的許多作用機(jī)制是通過(guò)釋放包含在分泌蛋白體概念下的各種生物活性物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[42]。分泌體由可溶性因子和胞外囊泡組成，如微泡或外泌體[33]。其被認(rèn)為是由約10%的人類基因組編碼[43]。分泌體在增殖、分化、通訊和遷移等細(xì)胞間相互作用和周圍組織中發(fā)揮關(guān)鍵作用[44]。

在眼部淺表疾病中使用分泌體的優(yōu)勢(shì)是可以防止傳統(tǒng)干細(xì)胞使用引起的一些不良反應(yīng)，包括對(duì)可能致癌的擔(dān)憂、缺乏允許異基因使用的免疫原性反應(yīng)以及感染的傳播[44]。干細(xì)胞被看作藥物倉(cāng)庫(kù)，可用于組合藥物的制造、遞送，并且可針對(duì)不同的臨床應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整[43]。

3 結(jié)論

盡管DED有許多治療方法，但近年來(lái)新的再生治療已經(jīng)鞏固了對(duì)這種復(fù)雜疾病治療的新觀點(diǎn)。因此有必要對(duì)DED的治療方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和比較，這是治療該疾病的重要希望，也是進(jìn)一步發(fā)展藥理學(xué)和細(xì)胞療法干預(yù)的機(jī)會(huì)。